SELECCIÓN MANTENIMIENTO Y

MEJORA DE CEPAS
INDUSTRIALES

Microbiología industrial
 I.- SELECCIÓN DE CEPAS MICROBIANAS
•El éxito de un bioproceso microbiano comienza con la adecuada selección del
microorganismo a utilizar, para lo cual se busca que:
•1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.
•2 Su velocidad de crecimiento debe ser alta.
•3. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos con medios de
cultivo de bajo costo.
•4. Fácil de conservar, sin pérdida de sus características particulares.
•6. Debe llevar el proceso fermentativo en poco tiempo.
•7. Debe lograr un alto rendimiento del producto y este debe ser de fácil
extracción (Merchuck, 2006).
•Los microorganismos pueden obtenerse por aislamiento a partir de fuentes
naturales o de una colección de cultivos.
•A nivel industrial, las empresas pueden poseer su propia colección de
organismos, naturales o mejorados genéticamente, que poseen gran valor
comercial.
 a.- Colecciones o bancos de cultivos

•Existen en el mundo, muchas colecciones depositarias de cultivos, como:

•"American Type Culture Collection", USA, la cual mantiene bacterias, levaduras,
algas, actinomycetes, mohos, protozoos, virus y líneas celulares;
•"Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes« del Institut Pasteur,
Francia;
•"Northern Regional Research Laboratory“ (NRRL), de Peoria, USA, y
•"National Collection of Type Cultures", Londres, Inglaterra.
 b.- Aislamiento del ambiente.

•La fuente última de todas las cepas es el ambiente natural, como agua, suelo,
plantas y desechos.
•Por ejemplo:
• en suelos tratados con pesticidas se pueden encontrar organismos
adaptados a la degradación de estos productos químicos; y
• en larvas de insectos muertos se encuentran los agentes causantes de la
muerte.
•Elegida la fuente de aislamiento, se escoge la técnica a usar:
•a) aislamiento directo,
•c) Enriquecimiento del cultivo: esta técnica consiste en incrementar en una
población mixta el número de organismos de interés en relación al resto,
mediante el empleo de medios de cultivo selectivos.
 II.- CONSERVACIÓN DE CEPAS
•Los objetivos de la conservación de los cultivos son:
•a) preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de sus propiedades
bioquímicas;
•b) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad

• Métodos de preservación o mantenimiento más importantes:

•a.- Subcultivo.
•Consiste en la resiembra (repique) periódica de la cepa en un medio de cultivo
fresco. El intervalo de transferencia varía con el microorganismo.
•Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 °C por 15 a 60 días.
•Inconvenientes:
•a) incremento de la posibilidad de mutación con cada transferencia, con
pérdida de las características del organismo;
•b) riesgo de contaminación;
•c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estadía en frío, en la cual se
produce una desecación gradual del mismo.
•b.- Congelación.
•Requiere:
•El crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, cuando las células son
más resistentes a los daños por congelación y descongelación.
•Utilizar una alta densidad celular, por que, parte de las células se lisan.
•La formación de hielo se inicia en el medio extracelular, lo que provoca un
aumento de la concentración de sales debido a la disminución del agua
cuando ésta se transforma en hielo, es decir, se produce un desequilibrio
osmótico.
Entonces las células se deshidratan por osmosis. Este efecto puede minimizarse
con las siguientes acciones:
•Controlando la tasa de enfriamiento mediante el uso de un congelador con
control de la tasa de congelación.
•Utilizando agentes crioconservantes.
•Manteniendo las temperaturas de almacenamiento adecuadas.
•Controlando la tasa de descongelación.
 Agentes crioconservantes.
•Los más utilizados son el DMSO y el glicerol.
•Se pueden dividir en dos categorías:
•Crioconservantes intracelulares con bajo peso molecular que hacen
permeables las células; por ejemplo el glicerol o el dimetil sulfóxido a
concentraciones entre 0,5M y 3M son efectivos minimizando el daño celular.
•Crioconservantes extracelulares con pesos moleculares relativamente altos
(mayores o iguales que el de la sacarosa) que no penetran en las células; son
más efectivos protegiendo sistemas biológicos que se congelan a tasas muy
rápidas. Aunque algunos de estos agentes tienen un efecto protector sobre la
membrana celular, parece ser que el mecanismo primario de acción es la
inducción de la vitrificación (formación de cristales extracelular).

•Todos los métodos de criopreservación comienzan con un paso inicial de

"precongelación", fase en la cual se transfieren las células desde un medio
fisiológico a una solución crioprotectora (medio tamponado que contiene
un crioconservante). Esta fase de precongelación conlleva una fase inicial
de enfriamiento (a menudo denominada "fase hipotérmica") que sirve a dos
propósitos:
•La suspensión celular es colocada en ampollas (vidrio o plástico) y sellada antes
de colocarla bajo nitrógeno líquido.
•El material biológico puede introducirse en la solución crioprotectora
previamente enfriada entre 0°C y 4°C y después colocada en una cámara de
criopreservación enfriada a 0°C – 4°C.
•La temperatura de conservación recomendada es -70 °C, ya que a temperaturas
más altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son
letales para las células.

•Parece ser que las células se cargan con solutos durante la lenta congelación y
esto, unido a su baja permeabilidad al agua, causa una lísis osmótica durante la
descongelación; por eso, la descongelación lenta en estos tipos de células
permite que haya suficiente tiempo para una correcta rehidratación y la pérdida
progresiva de los solutos acumulados (Miller y Mazur, 1976)
•C.- Mantenimiento bajo capa de aceite
•Consiste en cubrir el cultivo después de su desarrollo en medio sólido, con
una capa de aceite mineral o vaselina estéril.
•Se pueden conservar a temperatura ambiente o refrigerados por varios años.
•En estas condiciones los microorganismos pueden continuar
reproduciéndose, con posibilidades de aparición de mutantes.

•D.- Cultivos en tierra

•La tierra estéril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios días
para inducir esporulación.
•Producida la esporulacción, la tierra se seca y el cultivo se mantiene en
atmósfera seca o en refrigerador.
•El método es utilizado con hongos, actinomycetes y esporas de bacilos, para
varios años.
•E.- Preservación en celulosa
•Consiste en embeber tiras de papel filtro en una suspensión microbiana en suero,
glutamato de sodio u otro agente. Las tiras son después colocadas en tubos y
secados al vacío. De esta forma se conservan cepas de Streptomyces y Salmonella
por hasta 2 años a temp ambiente.

•F.- Liofilización (Es considerado el método mas adecuado de preservación. )

•Se parte de un cultivo de fase estacionaria resuspendiendo las células en un
medio crioprotector.
•Estas son congeladas a unos -40 °C y deshidratada por sublimación en vacío, hasta
valores de humedad del orden del 1%.
•Es apropiada para conservar bacterias, hongos en esporas y levaduras.
•No es adecuada para células animales, algas y hongos en fase de micelio.

•Suele ocurrir que el crecimiento después de la rehidratación tiene una fase de

retardo extendida.
 III.- MEJORAMIENTO DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES

•En general los organismos aislados de la naturaleza producen metabolitos de

interés en niveles muy bajos, por lo que es necesario incrementar estos
rendimientos para mejorar la rentabilidad de los procesos.
•Existen dos formas de mejorar el rendimiento:
•Mediante la optimización del medio de cultivo.
•Mediante el mejoramiento genético de la cepa.
Mejoramiento genético
•La obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por:
•1) Selección natural de variantes,
•2) Mutación inducida, y
•3) Recombinación genética.
 1. Selección natural

•Se conoce que en cada división celular hay una pequeña probabilidad de que
ocurra un cambio genético, en algunas células de una colonia.
•La frecuencia de mutaciones espontáneas varía entre 10-6 a 10-9 mutaciones
por genoma y por generación. Si se considera un valor de 10 -7 se deberán
estudiar unos (>10 7 ) organismos, en la búsqueda de un mutante.
•La selección de variantes naturales, se logra observando las características
morfológicas de las colonias, que se asocian con mayor o menor
productividad, lo que permite detectar los clones deseados.

•Un procedimiento simple de "screening" de mutantes, consiste en realizar un

plaqueo con medios selectivos usando drogas, metales, etc., donde solo
sobreviven los mutantes resistentes.
•Igual procedimiento se sigue sometiendo poblaciones a la acción de la luz
ultravioleta.
 2.-Mutación inducida.
•Implica dos etapas: el tratamiento de la población con un mutágeno y el
aislamiento de los mutantes.
•El empleo de diferentes agentes resulta en distintos "espectros" de mutantes.
•El incremento de su productividad puede ser resultado de modificar los
mecanismos de regulación metabólica y/o de una variación en los precursores
que llevan al producto.
•Esto requiere conocer las rutas y controles metabólicos.
•Los agentes mutágenos pueden ser:
•1) Físicos, como la luz UV (200 a 300 nm), por tiempos de 0.5 a 20 minutos,
tratando de lograr muertes entre el 90 y 99.9%.
•2) Químicos: En concentraciones de 0.05 M con exposiciones de 0.5 a 12 horas
a temperatura constante.
•(a) Acido nitroso, induce transiciones A-T --- G-C y/o deleciones por uniones
cruzadas en el interior de la cadena.
•b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), produce alta tasa de mutación con
baja mortandad.
c)Análogos de base, como 5-bromuracilo y 2-aminopurina, producen transiciones
d)Mutágenos estructurales, como proflavina o naranja acridina que actúan como
agentes de intercalado en la estructura, promoviendo adiciones o deleciones.
 2.1.-Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios
•La concentración de los metabolitos está regulada por dos sistemas principales: inhibición
y represión "feed back".
•En la inhibición, el producto final de una vía metabólica inhibe la actividad de una
enzima (normalmente la primera) de la vía, cuándo se alcanza un valor máximo de
concentración intracelular del producto (caso biosíntesis de aminoácidos).
•Esta enzima es de tipo "alostérica", y el producto final se une a ella en un centro regulador
(no compite con el sustrato por el centro activo), afectando la unión de la enzima al
sustrato. Es un control fino y casi instantáneo.
•La represión es aquella donde el producto final de una vía metabólica
previene la síntesis de una enzima o de todas las que catalizan la vía
mencionada.
•Esto ocurre impidiendo la transcripción del gen del ADN al ARNm. Este
mecanismo es de acción más lenta que el anterior, ya que permite actuar a
las enzimas preformadas.
•Los mecanismos de regulación son más complejos en caso de vías
biosintéticas ramificadas donde los productos de cada brazo son
raramente requeridos por el organismo en igual proporción.
Regulación de la Vía glicolítica
•La glicólisis se regula enzimáticamente en tres
puntos.
•En la primera reacción (G → G-6P), por la
enzima hexoquinasa, que se inhibe cuando hay
mucho G-6P.
•En la tercera reacción (F-6P → F-1,6-BP) por
medio de la PFK1, es la enzima principal de la
regulación de la glucolisis. Es controlada por
regulación alostérica: Se activa con elevados
ADP, se inhibe en abundancia de ATP y citrato.
•En el último paso (PEP → Piruvato) por la
piruvato quinasa. Esta se inhibe en presencia de
ATP y Acetil Coenzima-A, y se activa ante la F-
1,6-BP y la concentración de fosfoenolpiruvato.
 2.2.- Mutantes productores de enzimas de interés
industrial
•Las producción de enzimas degradativas, puede ser controlada por
inducción, represión "feed back" y/o represión catabólica.
•Las mutaciones pueden tener lugar en un gen regulador, eliminando la
producción de un represor activo (mutantes constitutivos).
•Los mismos pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en el cual el
sustrato inductor esté en concentraciones limitantes, lo cual favorece el
desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la población inducible.
2.3.- Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos
secundarios

•Un factor del proceso de control es la

regulación "feed back“, donde la
acumulación de metabolitos secundarios
(penicilina, cloranfenicol, cicloheximida,
cte.) limita su propia síntesis.
•En el caso de caminos ramificados como
el de penicilina, la acumulación intracelular
de lisina disminuye su producción,
efecto que se revierte por el agregado de α-
aminoadipato.
 3. Recombinación genética
•Naturalmente ocurre por:
•Los virus por infección mixta pueden intercambiar material genético entre
especies.
•En bacterias el fenómeno de recombinación se observa en:
•1) Conjugación: transferencia de material genético a través de pilis.
•2) Transducción: Transferencia de ADN de una célula a otra por un vector viral.
•3) Transformación: por inserción de un ADN aislado, a una bacteria receptora.
•Fusión de protoplastos. Proceso de fusión celular, seguida de fusión nuclear,
que produce intercambio de material genético entre diferentes especies.
Esta técnica se emplea en la obtención de hibridomas (células obtenidas por
fusión de células somáticas con células cancerígenas). Cada célula de hibridoma
sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo.
•El cultivo de este tipo de células produce anticuerpos monoclonales, que pueden
ser usados para combatir tumores.
 3.1.- logros en el desarrollo de cepas
•Quimosina recombinante (rennina) para la elaboración de quesos, se obtiene
en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados, y sustituye a la
quimosina de terneros y a la obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothia
parasitica).
•Síntesis de aminoácidos: Se han logrado mejoras en la producción de lisina,
acido glutámico y triptófano por bacterias Corynebacterium
glutamicum y Brevibacterium spp. En la mayor parte de los casos, se trata de
ampliar cuellos de botella metabólicos y eliminar mecanismos de retroinhibición
y de represión por producto final
•Somatotropina bovina recombinante pare estimular la producción de leche de
vacas en los EE.UU. (aprobada por la FDA en 1994 para Monsanto, con el
nombre comercial de Prosilac, pero no en la UE)
•En la industria de detergentes:

•La Lipolasa de Novo-Nordisk (ahora Novozymes) es la primera enzima

recombinante aprobada para detergentes. El gen de esta lipasa, aislado del
hongo filamentoso Humicola se transfirió a Aspergillus oryzae.
•La cutinasa de Fusarium, que degrada ácidos grasos, se expresa por
ingeniería genética en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
•Entre las proteasas, la subtilisina de Bacillus licheniformis y B.
amyloliquefaciens, ha sido mejorada, creando variantes resistentes a la
oxidación por peróxido de hidrógeno derivado de los perboratos, resistentes
a pH alcalinos y termorresistentes.
•Por "ingeniería de proteínas" se logró cambiar el aminoácido (Met-222) por
(Ala-222), logrando que la nueva subtilisina resista a la lejía.
•Por métodos parecidos se han diseñado variantes que soportan altas
temperaturas.
•Producción de plásticos biodegradables. Se sabe que bacterias
como Ralstonia eutropha, producen gránulos de reserva del plástico
biodegradable PHA.
•La ruta de síntesis de polihidroxibutírico (PHB) de la
bacteria Ralstonia eutropha se ha clonado en otras bacterias y en
plantas. Monsanto ha fabricado el Biopol, copolímero de
hidroxibutírico e hidroxivalérico, que se usa en dispostivos quirúrgicos.
•Jugando con los precursores suministrados se pueden lograr
copolímeros con distintas propiedades plásticas y elásticas: PHA de
longitud de cadena media, con monómeros C6 a C16, y distintos
grupos funcionales, lo que permite modificar la estructura y
propiedades físicas del polímero.
•El costo actual de obtención de los PHA es más de 10 veces superior
al de los petroplásticos.
•Se estudia abaratar los costos de cultivo, con plantas transgénicas.
Es posible que en un futuro los precios sean competitivos.
•(Iañez)
 3.2. Desarrollos en perspectiva.
•La bacteria Xanthomonas campestris produce xantano, un exopolisacárido con
aplicaciones industriales como agente emulsificante y espesante.
•Para lograr un proceso industrial rentable, se diseñan cepas de esta bacteria que puedan
usar como fuente de carbono desechos industriales, como el lactosuero de quesería.

•Las melaninas, usadas para bronceadores y protectores solares de, se suelen obtener de
modo químico. Se han localizado y aislado los genes de síntesis de melanina en la
bacteria del suelo Streptomyces antibioticus, y se han transferido a otras bacterias más
fáciles de manejar, lográndose en ellas su expresión.

•Se quiere producir adhesivos biológicos por ingeniería genética. Por ejemplo, se aisló el
gen de una proteína adhesiva del mejillón (Mytilus edulis), y se ha logrado expresar en
microorganismos. Se espera que de tener éxito, esta proteína pueda emplearse en
adhesivos para dentistas y médicos.

•Se estudia la obtención de caucho por ingeniería genética, a partir de genes de la planta
productora (Hevea brasiliensis).
•Síntesis del índigo (colorante para la tela denim), hoy se produce a partir de
sustancias químicas peligrosas como anilinas, formaldehido, cianuro, etc., y es
contaminante. Se ha desarrollado bacterias de E. coli manipuladas
genéticamente a las que se ha logrado transferir un conjunto de 15 genes
(naftalenodioxigenasa, ruta del corísmico, etc.), de Pseudomonas y la nueva
cepa es capaz de producir índigo a niveles rentables (Iañez).

•Alteración de la proporción de lignina en árboles. Se estudia formas de

modificar la cantidad y calidad de la lignina, lo que posibilitaría procedimientos
mas sencillos para obtener la pulpa de papel (Merkle y Dean 2000).

•Microorganismos extremófilos y sus correspondientes enzimas, se aíslan de

Arqueas hipertermófilas. La más popular es la ADN polimerasa
termorresistente de Thermus aquaticus, y otras similares, empleadas en la
PCR.
•Producción de fibras proteicas de telaraña en bacterias, plantas y
animales.
•“Científicos del Massachusetts Institute of Technology (EE.UU.) han
desarrollado una fibra sintética similar a la telaraña, modificando
genéticamente bacterias para que produzcan las proteínas. Aunque aún no
es tan fuerte como los materiales naturales, los científicos creen que pronto
conseguirán igualar su fortaleza e incluso superarla.”
•Las fibras se pueden usar para suturas, o para sustituciones de órganos-
hechos de seda sintética, con propiedades específicas para su uso.
•Además las fibras podrían emplearse en la fabricación de chalecos
antibalas o materiales de protección y elementos de seguridad vial (como
vallas, parachoques, etc.), gracias a la capacidad de la seda de araña para
absorber grandes cantidades de energía mecánica antes de su fractura.
(Gómez Abajo, 2015)
 2.5.-Inconvenientes de los mutantes
•Los programas de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a menudo no dan
los resultados deseados.
•La mutagénesis origina mutaciones aleatorias en el organismo, la mayor
parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o empeoran algunas
de sus características originales. Mutaciones que conducen a la aparición de
propiedades nuevas positivas son raras, y el proceso de su búsqueda es
complicado.
•Esto obliga a trasladar la mutación "positiva" a un fondo genético distinto (cepa
silvestre previamente seleccionada). Esto complica y alarga la mejora genética.
•Los organismos seleccionados pueden acumular mutaciones desconocidas
•En las especies dotadas de sexualidad, la mejora por recombinación genética
está limitada al cruce entre razas de la misma especie, o de especies
compatibles
REFERENCIAS
•Gomez Abajo Carlos. Crean una telaraña artificial casi tan fuerte como la de
la naturaleza. Revista electrónica de ciencia, tecnología, sociedad y cultura.
ISSN 2174-6850
•DORDICK, J.S., Y.L.. KHMELNITSKY, M. V. SERGEEVA (1998): “The
evolution of biotransformation technologies”, Current Opinion in
Microbiology 1,311-318.
•Iáñez Pareja Enrique. Ingenieria genetica industrial. Instituto de
Biotecnología, Universidad de Granada.
https://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/ingenetindustrial.htm.
•Mateos Pedro F. Producción industrial de metabolitos secundarios.
•MERKLE, S.A., J.F.D. DEAN (2000): “Forest tree biotechnology”, Current
Opinion in Biotechnology 11, 298-302.
•Merchuk José. Microbiologia industrial. Departamento de Educación, Cultura,
Ciencia y Tecnología. Organización de los Estados Americanos. Washington,
D.C. 2006, USA.