Bài giảng kỹ thuật

xác định trình tự gen

 Nội dung
 Kỹ thuật xác định trình tự gen
 Công nghệ sinh học nano
Kỹ thuật xác định trình
tự gen
 Nội dung
 Nguyên lý của các phương pháp phân tích trình tự gen
• Phương pháp Sanger
• Phương pháp Maxam-Gilbert
 Phương pháp phân tích trình tự gen tự động
• Hoá học/ Phản ứng chuỗi (dây chuyền) polymerase
• Thiết bị
• Các phần mềm/ Các cơ sở dữ liêu gen quốc tế

• Xử lý số liệu/ Đăng ký dữ liệu gen

DNA/RNA
Cấu trúc phân tử của đường Ribose và Deoxyribose
Trạng thái tự nhiên Trạng thái biến tính sợi đơn Trạng thái lại tính
 ĐINH NGHĨA: GIẢI TRÌNH TỰ GEN

• Là phương pháp thực nghiệm để xác định trình tự

nucleotide của một đoạn ADN
• Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trọng
một đoạn ADN
www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene27.html
• Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di
truyền.
www.mwgbiotech.com/html/glossary/glossary_overview.s
html
 Lịch sử phân tích trình tự gen
 1870 Mischer: Phát minh DNA
Hiệu suất  1940 Avery: DNA là “chất liệu di truyền”
bp/người/năm  1953 Watson & Crick: Cấu trúc xoắn kép của DNA
1  1965 Holley: Trình tự của tRNA nấm men
15  1977 Wu: Trình tự của đầu dính DNA thực khuẩn
150  1977 Sanger: Phương pháp dừng chuỗi bằng dideoxy
1.500  Maxam & Gilbert: Phương pháp phân giải hoá học
25.000
 1980 Messing: Chọn dòng trong thực khuẩn M13
50.000  1986 Hood et al: Tự động hoá một phần
 1990 Phân tích trình tự bằng chu trình nhiệt (PCR); các
enzyme được hoàn thiện để đọc trình tự; các hệ thống dò
huỳnh quang được hoàn thiện (đọc qua ống mao dẫn)
200.000  2002 Tự động hoá phòng thí nghiệm

53.000.000
Phân bố số lượng genom đã được giải trình tự
hoàn toàn ở các sinh vật

Archea (16)

Eukarya (20)

Bacteria (139)

Viruses (1500)
 NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
Phương pháp Sanger

Frederick (Fred) Sanger

Phương pháp Maxam-Gilbert

Walter Gilbert
 Phản ứng chuỗi/dây chuyền (của/bằng/nhờ/do)
Polymerase
Polymerase Chain Reaction (PCR)

Kary Mullis

Giải Nobel về hoá học, 1993

 POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR

A 'licence' to do molecular biology

A key central technique that has revolutionised molecular and
consequently cell biology

devised by Kary Mullis c1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction.
Scientific American. 262 (4) 56-65.
Schematic illustration of PCR steps
Sơ đồ minh họa các buớc PCR

From: Recombinant DNA by Watson,

Gilman, Witkowski & Zoller
 Target Amplification
No. of No. Amplicon
1 cycle = 2 Amplicon Cycles Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon
1 2
3 cycle = 8 Amplicon
2 4
4 cycle = 16 Amplicon
3 8

5 cycle = 32 Amplicon 4 16

5 32
6 cycle = 64 Amplicon
6 64

20 1,048,576
7 cycle = 128 Amplicon
30 1,073,741,824
Các phương pháp xác định trình
tự gene
1. Phương pháp Maxam-Gilbert (hoá học)
Phương pháp được phát minh đầu tiên nhưng đến
nay ít được sử dụng, chỉ dùng cho
“footprinting”

2. Phương pháp Sanger (enzyme)

Sử dụng DNA polymerase, primer, dNTP và một
lượng nhỏ ddNTP (để kết thúc chuỗi)
 PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
Sợi đánh dấu (P32)
ddNTP Reaction Mix
5’-
Xử lý bằng hoá
4 ống chất cắt đặc
hiệu tại một C T A G
base nào đó
G-rxn A>G T>C
3’
-rxn C-rxn -rxn
G
C
5’- A
T
C
T
C
5’- C
C A
T
A
5’- G
C G
5’ autoradiograph of dried
Khi phản ứng kết thúc mỗi sợi chỉ sequencing gel
được cắt 1 lần
Trình tự được đọc trực tiếp
 PHƯƠNG PHÁP SANGER
End labeled primer
ddNTP Reaction Mix
5’-
DNA
4 tubes Polymerase
+dNTPs
C T A G
ddTTP ddATP + one of:
ddCTP 5’
ddGTP C
G
T
5’- A
C A
G
G
5’- T
C A
T
C
5’- C
C 3’ autoradiograph of dried
sequencing gel
In the ddGTP reaction there is a
random chance a ddGTP will be Sequence is complementary
incorporated across from a C to the strand being sequenced!
DNA Sequencing sau khi tạo dòng phân tử
Cloned
fragment

Primer
Primer Binding sites

Plasmid (or phage)

with cloned DNA
fragment
 Dideoxy-Nucleotides

Base Base
(P)-(P)-(P)- O (P)-(P)-(P)- O

OH H H H
dNTP ddNTP
If a ddNTP is added to
a growing DNA chain,
the sequence is
terminated, because
another base can not
be added
 Dideoxynucleotides
 DNA Sequencing using the Sanger
method involves the use of 2’3’- 2’-dideoxynucleotide
dideoxynucleotide triphosphates in monophosphate
addition to regular 2’- OH
Phosphate
deoxynucleotide triphosphates HO P O NH2
 Because 2’3’-dideoxynucleotide Base
N N
triphosphates lack a 3’ hydroxyl O
group, and DNA polymerization N N
occurs only in the 3’ direction, 5’ CH2
O
once 2’3’-dideoxynucleotide 4’ 1’
triphosphates are incorporated, Sugar 2’
3’
primer extension stops
OH
H H

2’3’-dideoxynucleotide
monophosphate
 CH
3

OH O
H OH

SUGAR-PHOSP
NH2
HO P O N
H N
N
O N
O

B A S E
N O
CH2 N CH2
O
O

2’3’ O P OH

dideoxy- O H N
H2 OH

2’3’dideoxynu
O H H
nucleotides HO P O
N
NH
N
N

Terminate
O
H
O
N NH2

S
CH2 N O
DNA
ATE BACKBO

O CH2

cleotide
O

Replicaton O
P HO
O H
NH2 O N
H O
H H2O
HO P O
N N
O HN
N
N O N O
CH2 H2
O CH2
O
NE

O HO
OH H P
HO
 Phương pháp phân tích trình tự gen tự động

 Hoá học: Phản ứng chuỗi (dây chuyền) polymerase

 Các thiết bị
 Các phần mềm/ Các cơ sở dữ liêu gen quốc tế
 Xử lý số liệu/ Đăng ký dữ liệu gen
The dideoxy method has been
modified so it can be done in one
tube. In this case all of the
ddNTP’s are labeled with different,
coloured fluorescent molecules

This makes automation much

simpler, reduces the cost of the
reactions, and speeds up the
process tremendously. Large
sequencing centres use this
method and can read millions of
bp every single day
Sequencing Data
 Máy giải trình tự DNA tự động
(Automated DNA Sequencers)
 ABI: ABI 377, 310, 3100, 3100 Avant, 3700, 3730…
 Amersham: MegaBace 500, 100
 Beckman-Coulter: CE2000, 8000
 Li-Cor:
 Shimatzu: DSQ1000, 2000…
 …
 Tại Việt Nam:
 ABI 3100 Avant (4 capillaries): 5/ VCNSH, TTCNSH (ĐHQGHN); ĐHYHN,
VVSDTTW (sắp mua 2?)
 ABI 310 (1 Capillary): 4/ĐH Thái Nguyên; VDTNN, VKHHS, ĐH Cần Thơ?
 ABI 377: 1/ VKHHS
 Pharmacia Biotech ALF: 4/ĐHKHTN ĐHQGHN, ĐHKHTN ĐHQGtpHCM,
VCNSH, ĐHBK
 Beckman- Coulter CE2000: 2/Viện Pasteur TPHCM; TT Welcome Trust)
 ??? Viện Chăn nuôi, VQY108, HVQY...
 ABI sequencers

ABI 371 ABI 373

ABI 377
ABI Automated Sequencers (contd.)

ABI 310
ABI 3700

ABI 3100
ABI 3100Avant
 Lý giải trình tự DNA

Khung đọc mở 1 Khung đọc mở 2

123123123

654654654
Các Cơ sở dữ liệu gen Quốc tế
NCBI (USA); EMBL/EBI (EU); DDBJ (Nhật Bản)

Bùng nổ thông tin sinh học !!!

NCBI- Trung tâm Quốc gia về Tin học Công nghệ Sinh
học Hoa Kỳ

Cơ sở dữ liệu gen: GENBANK

Số trình tự gen được đăng ký trong các Ngân hàng gen
quốc tế tăng lên hàng năm theo hàm số mũ (exponential)

Currently 1.200.000
5.4 Million
1.000.000
Sequence
Entries in 800.000
GenBank
600.000

400.000

4.6 Billion Bases 200.000

from ~50,000
0
Species 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995