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A histone H3 methyltransferase

controls DNA methylation in


Neurospora crassa

Hisashi Tamaru & Eric U. Selker


Institute of Molecular Biology, University of Oregon, USA.
NATURE, 2001.

Cristina CEVALLOS
M1 - GMC
La méthylation des cytosines dans
l’ADN
Développement des espèces dans les
règnes animal et végétal.

Régulation de l’expression de certains


gènes selon différentes conditions

Le développement
embryonnaire

L’inactivation
du X
Mutations qui affectent les ADN-
méthyltransferases.
La réduction de la méthylation entraîne des
Chez Arabidopsis thaliana anormalités du développement et la stérilité
partielle des femelles.

Chez les mammifères Si l’embryon ne peut pas méthyler son ADN il


décède à l’état de morula.

 Méthylation pas essentielle chez le champignon filamenteux Neurospora crassa.

 Facilité pour trouver des mutants qui impliquent la méthylation pour


comprendre son rôle fonctionnel.
Groupe de mutants dim (défectueux in
methylation)
dim-2 Méthylation complétement défectueuse.

Mutation inattendu
Région 80kb
Réduction du 50% de la méthylation totale de
dim-3 Gène cherché: homologue
l’ADN.
histone méthyltransférases
(Drosophile, S. pombe,
mammifères)

dim-5 Défaut de la méthylation de l’histone H3


Retard de croissance
chez les souches mutants

Figure 1. Défauts de la croissance des souches dim-5. Ratios de croissance apicale


de 10 souches WT (dim+) et 10 mutants (dim-5).
Méthylation de Méthylation de
Protéine DIM-5
l’histone H3 l’ADN

Reemplacement de Perte de méthylation


K9 dans l’histone H3 de l’ADN in vivo
1,5% de cytosines méthylées chez N.
crassa dans les reliques de RIP et l’ADNr

RIP: repeated induced point mutation –


mécanisme de protection du génome

Digestion par DpnII (D) et Sau3AI (S) 


reconnaissent la séquence GATC mais
Sau3AI est inhibée par la méthylation des
cytosines

Digestion des ADN génomiques par D et S


pour révéler les profils de digestion totaux.

La région 9A20 de dim-5 présente un RFLP


par rapport à WT et dim-2

Figure 2. Défauts de méthylation dans la


souche mutant dim-5.
Cartographie du gène dim-5

En analysant la
distance
Marquage de la
Groupe IV de Croissement génétique on a
mutation :
liaison avec différentes trouvé que le
Hybridation
génétique souches gène d’intérêt
Southern
se situe entre
trp-4 et leu-2
Identification du cadre de lecture de
dim-5

Figure 3. Cartographie génétique et complémentation du gène dim-5.


a.Carte génétique de l’intervalle leu-2/trp-4 du contig 1.118 révélée par BLASTx.
b.Complémentation de la mutation dim-5.
L’expression d’un transgène réprimé
par « quelling » de dim-5

Figure 4. « Quelling » dim-5


enlève la répression de hph (Dim+)
dans la souche N644 (WT)
Dim-5 a une mutation non-sens dans
le domaine SET
Quelques protéines
PCR & séquençage Une seule mutation
SET sont protéines
de l’ORF CàG
méthyltransférases.

Codon sérine
WT (TCA La possibilité
 TGA) que ces
protéines
soient
Position 216 HMTases été
dim-5 mutant de 318 examinée.
(130AA)
DIM-5 est une protéine avec domaine
SET

Figure 5. a. Alignement de régions conservées entre espèces. b. Organisation du domaine


protéique de DIM-5 et protéines relatées.
dim-5 code pour une histone H3
méthyltransférase.

S-adénosyl-[methyl-3H]-
Construction d’une
rDIM-5 purifiée à partir L-méthionine comme
protéine de fusion (GST)
de E. coli donneur de groupes
+ DIM-5 ORF
méthyl

Fluorographie et
scintillation pour la
Incubation avec histones Fractionnement par
vérification de
de thymus du veau SDS-PAGE
l’incorporation de
groupes méthyl
• Incorporation significative de
rDIM-5
intacte groupes méthyl étiquetés
aux histones.

• Histone H3 comme
accepteur de quasiment
toute la méthylation.

Figure 6. Activité méthyltransférase de la


protéine DIM-5 recombinante (rDIM-5).
Mutation in vitro du gène hH3
Remplacement du codon lysine par un codon
leucine ou arginine par co-transformation.

Structuralement similaire à la lysine

La leucine (neutre) peut mimer une lysine acétylée

L’arginine (chargée +) peut mimer une lysine


désacétylée

On sait que a leucine n’est pas un substrat pour la


méthylation chez la Suv39h1 HMTase recombinante.
Réactivation de hph et perte de la méthylation induite
par la transformation d’une souche avec des allèles
mutants du gène de l’histone H3 (hH3).
Méthylation de
l’histone H3 est
critique pour la
méthylation de l’ADN

Figure 7. a. Séquence du segment N-terminal de l’histone H3 chez Neurospora. b. Expérience


de transformation. c. Analyse par Southern et séquençage d’ADN des transformants Hygr.
Est-ce que RIP génère
l’hétérochromatine ?
- Séquences modérément répétées
(transposons)
- Riche en
- Séquences hautement répétées
(ADN satellite)

- L’ADN dirige sa formation


Hétérochromatine constitutive - Localisée près du centromères et télomères
chez les eucaryotes
- Reste condensée après la mitose  réplication
en retard dans la phase S
- Faible recombinaison génétique
- Contient formes spéciales d’histones
- Hyperméthylée chez les mammifères et les
plantes
Chez Drosophila melanogaster

http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/HeterochromID30058FS.html
Est-ce que RIP génère
l’hétérochromatine ?
Les reliques de RIP Dim-5 croissance
Séquences mutées par
peuvent être à la base et irrégulière et stérilité
RIP Concentrées dans
avoir la fonction pour les partielle en croissements
l’ADN centromérique
centromères homozygotes

Liés par protéines dont Montre que DIM-5 est


Nucléation de la
sa spécificité de impliquée dans d’autres
hétérochromatine
séquence est limitée processus différents

En recrutant des RIP détecte les En dehors de la


protéines de séquences dupliquées méthylation de l’ADN
l’hétérocrhomatine lors de la phase sexuelle comme la formation de
comme la DIM-5 HMTase et mute: G-C à A-T l’hétérochromatine
Histones comme transducteurs de
signaux pour la méthylation de l’ADN
 Evolution entre les bactéries et les eucaryotes :
Adaptation de la méthylation grâce aux histones

 Histones agissant comme des obstacles pour l’accès à l’ADN

 Dépendances des histones comme co-facteurs pour se fixer sur


l’ADN

 Modification des états de la chromatine = rôle intégrateur


Histones comme transducteurs de
signaux pour la méthylation de l’ADN

Méthylation ou acétylation de la K9 = combinaison de plusieurs signaux sur ce résidu

http://evobio.blog.lemonde.fr/2013/12/08/lautisme-la-genetique-et-lepigenetique/
Méthylation de novo et de
maintenance de l’ADN chez les
eucaryotes
Modifications épigénétiques sont conservées par maintenance de la méthylation

Méthylation se fait de manière symétrique, sinon il faut une DMTase spécifique des sites
hémi-méthylés

Observation de la maintenance et propagation de sites hémi-méthylés (Neurospora et


eucaryotes)

Dépendant de boucles de régulation “protéines modificatrices de la chromatine et


l’ADN”

 importance du chromo domaine de Su(var) 3-9 et Clr4 + H3K9 : méthylation


préférentielle des histones mais pas de l’ADN (Drospophile et S.pombe)

 DIM5-HTMase et G9a HTMase : pas de chromo domaine !


Importance du modèle Neurospora
crassa dans l’expérience.
• Méthylation non – essentielle
• Mécanisme de répression post-
transcriptionnelle des gènes (PTGS) 
“Quelling” (ARNi) (En meiose)
• RIP  Repeated induced point mutations
(phase végétative)
CONCLUSIONS
• dim-5 est requis pour la méthylation de l’ADN
et pour la croissance et fertilité normale de
l’organisme
• Les HMTases sont impliquées en la formation
de la chromatine
• La méthylation de l’ADN dépend de la
méthylation des histones.