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LE CARYOTYPE HUMAIN

Techniques conventionnelles

Hélène ZATTARA
• Étude morphologique du matériel
chromosomique se présentant sous la forme
de chromosomes dans les cellules des
eucaryotes
• l ’étude du caryotype correspond au
dénombrement et à l ’identification de
tous les chromosomes
• cellules en métaphase (prophase)
• anomalies de nombre et anomalies de
structure
Qu’est ce qu ’un chromosome?
• Chromosome constitué d ’une molécule d ’ADN
associée à de nombreuses protéines

• les chromosomes servent de support à


l ’information génétique
• nombre de chromosomes par cellule
caractéristique d ’une espèce
• chez l ’homme 46 chromosomes (2 jeux
haploides de 23 chromosomes)
Centromère

• Constriction primaire
• Structure complexe
• Etroitement associé à une structure protéique : le
kinétochore
• Sépare en 2 le chromosome :
– bras court p
– Bras long q
– Index centromérique = p/p+q
Constrictions secondaires
Chromosome 1
Chromosome 9
Chromosome 16
Chromosome Y
Constrictions 1aires et 2aires
• Constituées d’ADN hautement répétitif :
hétérochromatine constitutive (ainsi qu’au
niveau des bras courts des chromosomes
acrocentriques)
• 10% génome humain
ADN satellites
• ADN  satellite : sur toutes les paires
chromosomiques localisé dans les régions
centromériques
• ADN  satellite : localisé dans les régions
péricentromériques des chromosomes 1, 9
et Y et sur les bras courts des chromosomes
acrocentriques
ADN satellites
• ADN sat 1 : réparti sur de nombreux
chromosomes
• ADN sat 2 et 3 :dans les régions
centromériques et régions
hétérochromatiques des chr 1, 9, 16 et Y. Ils
seraient également impliqués dans le
mécanisme de remaniement des
chromosomes acrocentriques
centromère

Étroitement lié à une structure protéique : le


kinétocore sur lequel s’insère les fibres
fusoriales lors de la métaphase (complexe
jouant un rôle essentiel dans la séparation
des chromosomes)
Télomère
• Maintiennent l’intégrité des chromosomes
et ont des propriétés répulsives
• Constitué d’une séquence de 6pb
5’TTAGGG3’ longueur 2 à 30 kb
Techniques d ’obtention des
prréparations métaphasiques
• Chromosomes visibles que pendant une
courte période du cycle cellulaire : division
• toutes les techniques visent à obtenir un
maximum de cellules bloquées à ce stade

• cellules en multiplication active soit


spontanément soit par une culture
Prélèvements
• Sang
• fibroblastes
• cellules amniotiques, villosités
choriales,sang fœtal
• moelle osseuse
• tissu tumoral ou ganglionnaire
Cultures cellulaires
• Stérilité +++
• milieu de culture stérile avec des
antibiotiques et antifungiques
• milieu de culture : milieu synthétique
enrichi en sels minéraux, glucose et acides
aminés auquel on additionne du sérum de
veau fœtal
Sang :caryotype constitutionnel
• Sang total + milieu de culture
• phytohémaglutinine (stimulation des
lymphocytes T)
• 72 heures à l ’étuve
Sang et moelle : hémopathies
malignes
• Rincer les cellules dans du milieu de culture
puis centrifugation
• récupération de l ’anneau des cellules
mononucléées
• numération cellulaire
• mise en culture en flacon Falcon
• +/- mitogènes
Tissus solides
• Dilacération du fragment dans une boite
stérile avec du milieu de culture
• numération des cellules dans le surnageant
• mise en culture en flacon Falcon
• surveillance quotidienne au microscope
inversé
Cultures cellulaires
• Air enrichi en CO2
• pH compris entre 7.2 et 7.4
• température stable de 37°C
• temps de culture variable en fonction du
prélèvement
Arrêt de la culture
• Agent bloquant du fuseau mitotique
(colchicine ou sulfate de vinblastine)
• permet de bloquer les cellules en métaphase
Choc hypotonique
Indispensable à l ’obtention d ’un
étalement correct des chromosomes

• KCl ou MgCl2
• éclatement des membranes
cellulaires et dispersion
des chromosomes
Fixation des préparation
métaphasiques
• 3 fixation avec un mélange
éthanol/acide acétique
• on obtient un culot de cellules
fixées que l ’on remettra
en suspension pour l ’étape
suivante : étalement sur lame
Etalement des préparations
chromosomiques sur lame
L ’étalement a pour but d ’obtenir des
métaphases avec des chromosomes bien
séparés et non réfringents
• Faire tomber une ou 2 gouttes de suspension
cellulaire sur une lame
• étape dépendantes des conditions
atmosphériques enceinte thermostable
Technique de coloration des
chromosomes métaphasiques
1/ TK directe
– a/Giemsa
permet de compter les chromosomes
classement en fonction de la taille et de
l ’index centromérique
Bandes Q
DENATURATION DES PREPARATIONS CHROMOSOMIQUES
Les préparations sont ensuite dénaturées afin d’obtenir la visualisation
de bandes sur les chromosomes.
Ces techniques sont basées sur le principe de la dénaturation de l’ADN
par la chaleur ou les agents chimiques, permettant la mise en évidence
d’une striation en bandes transversales
( alternance de bandes sombres et de bandes claires).
Le principe consiste à séparer les 2 chaînes d’ADN par des agents physico-chimiques
ou enzymatiques.
L’arrêt de ces traitements entraîne une réassociation des 2 chaînes
en des points particuliers ( renaturation)
Puis on colore les lames au Giemsa.

DENATURATION THERMIQUE
Technique de coloration des
chromosomes métaphasiques
2/ Techniques de dénaturation
bandes G
• coloration au Giemsa après dénaturation à
la trypsine
• avantage : technique rapide
• inconvénients : les télomères apparaissent
peu colorés
Technique de coloration des
chromosomes métaphasiques
2/ Techniques de dénaturation
bandes R
• coloration au Giemsa après dénaturation
thermique en mileu salin à pHdéterminé
• résultat en négatif des bandes G
• avantage : les télomères sont bien colorés
• inconvénients : technique longue et
dépendante de nombreux paramètres
Chromosome 4
Bandes G Bandes R
Technique de coloration des
chromosomes métaphasiques
3/Techniques de marquage complémentaires

• bandes C : hétérochromatine constitutive


• NOR : organisateurs nucléolaires
Coloration NOR :imprégnation argentique
Technique de haute résolution
Chromosomes déspiralisés en prométaphase
visualisation des sous-bandes
chromosomiques
• Synchronisation des cultures associée à
l ’incorporation d ’analogues de bases
(bromodésoxyuridine ou BrdU)
• modification des propriétés tinctoriales des
bandes chromosomiques
• 700 à 1000 bandes
Observation au microscope
• Visualisation des lames au microscope
optique

• 20 métaphases au moins sont


photographiées et analysées

• logiciel de saisie d ’image et logiciel


d ’analyse
Classement du caryotype
Caryotype humain : 46 chromosomes

• autosomes : 1 au 22
• gonosomes: X et Y

– femme : 46,XX
– homme : 46,XY
Classement du caryotype
Index centromérique
rapport p/(p+q)
• chromosomes métacentriques
– IC=0.5 (chr 1,3,16,19,20)
• chromosomes submétacentriques
– IC=0.4 (chr 2,6,7,X,8,9,10,11,12)
• chromosomes subtélocentriques
– IC=0.2 (chr 4,5,17,18,Y)
• chromosomes acrocentriques
– (chr 13,14,15,21,22)
A
s
p
e
c
t
s
m Subtélocentriqueses
o
r
p
h
o
l
o
g
i
Classement des chromosomes
• Fonction de leur taille
• de leur index centromérique
• de la reconnaissance après marquage de chaque
chromosome : nombre et répartition des bandes
spécifique à chaque paire chromosomique

Nomenclature internationale définit pour


chaque chromosome des régions
chromosomiques qui comporte des bandes et des
sous-bandes
Classement du caryotype
• Groupe A : 1 2 3
• Groupe B : 4 5
• Groupe C : 6 à 12 X
• Groupe D : 13 14 15
• Groupe E : 16 17 18
• Groupe F :19 20
• Groupe G :21 22
21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande
Variants normaux
• Différence de taille entre les chromosomes
1, 9, 16 homologues du fait d’une différence
de taille des constrictions secondaires
• Présence de satellites géants ou de double
satellites sur les chromosomes
acrocentriques
• Y
Chromosome 1
Anomalies chromosomiques
• Constitutionnelles : anomalies
chromosomiques survenues avant la
fécondation ou lors des 1ères divisions du
zygote
• Acquises : anomalies chromosomiques
apparues au cours de la vie et ne touchant
qu ’un seul organe
Anomalies chromosomiques
• Homogènes : toutes les cellules présentent
l ’anomalie chromosomique
• En mosaïque : 2 populations à caryotype
différent issues du même zygogte

• anomalies chromosomiques héritées


• anomalies chromosomiques de novo
Anomalies chromosomiques

• Anomalies de nombre

• Anomalies de structure
– équilibrées
– deséquilibrées
Indication du caryotype
1/chez le nouveau-né
• nouveau-né mort-né ou décédant à la
naissance
• nouveau-né vivant présentant un tableau
clinique évocateur d ’une aberration
chromosomique
• nouveau-né vivant présentant un tableau
malformatif ou dysmorphique atypique
Indication du caryotype
2/ chez l ’enfant
• chez le garçon : handicap mental moyen ou
profond
• chez la fille : -retard de croissance
» -hernie de la gonade
3/ chez l ’adolescent
• anomalies de la puberté
Indication du caryotype
4/ chez l ’adulte
• naissance d ’un enfant présentant une
anomalie chromosomique
• fausses couches spontanées à répétition
• stérilité masculine
• ménopause précoce
Indication du caryotype en
hématologie cancérologie
Processus cancéreux très souvent associés à
des remaniements chromosomiques ,parfois
spécifiques

Intérêt du caryotype
• diagnostique
• pronostique
• thérapeutique
Indication du caryotype en haute
résolution
• Examen de 2ème intention

• préciser les points de cassures d ’un


remaniement dépisté sur un caryotype
standard
• rechercher un microremaniement quand la
clinique évoque trés fortement l ’existence
d ’une anomalie chromosomique et que le
caryotype standard est normal