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WHOLE BLOOD ACTIVATION RESULTS IN ALTERED T CELL AND

MONOCYTE CYTOKINE PRODUCTION PROFILES BY FLOW


CYTOMETRY Brian E. Crucian and Clarence F. Sams

Flores Mirón Enrique | Dra. Irlanda Olvera Gomez| Lab. Inmunologia HNH
Introducción

• Un excelente monitor del equilibrio inmune de las células


circulantes periféricas es determinar su patron de
producción de citocinas en respuesta a estímulos. Usando
citometría de flujo, se puede realizar una identificación
positiva de citocinas en un cultivo mixto.

• Recientemente, la capacidad de evaluar la producción de


citocinas después de un cultivo de activación de sangre
total se ha descrito. En el presente estudio, la activación de
la sangre completa se hizo en comparación con la
activación tradicional de las PBMC y los patrones de
secreción de citocinas individuales para las células T y
monocitos
Diferencias de estimulación ( PBMC / ST)

Tipo de Ensayo Ventajas Desventajas


Se requieren volúmenes de Las muestras generalmente
muestra mas pequeños necesitan diluirse en RPMI
Sangre Total Representa completamente la Los resultados de citometria
respuesta celular y los pueden no solamente reflejar
componentes solubles que la producción de citocinas de
intervienen en la presentación la célula de interés
de antígeno

La descripción de la Mayores insumos necesarios ,


producción de citocinas es y perdida de viabilidad de
especifica a la célula de células al momento de aislar
interés sin considerar otros
PBMC elementos del plasma
Condiciones mas controladas La activación celular resulta
diferente a un modelo ideal de
estimulación completa
Diferencias de estimulación ( PBMC / ST)

Variables Variable Variable


controladas independiente dependiente
• Estas se • La única • La medida del
mantienen variable que se cambio
idénticas en cambia a observado a
todos los propósito y se causa de la
experimentos somete a variable
pruebas independiente
• Decida cómo va
a medir el
cambio
Pregunta científica :

¿La estimulación de sangre total,


altera los niveles de expresión de
citocinas en linfocitos T y
monocitos?

Hipótesis
Materiales para estimulación de sangre total y
PBMC’s

Materiales (lista detallada)

Donadores de sangre (Sanos)

Soluciones de trabajo

RPMI 1640

PMA

Ionomicina

Monensin

LPS
Procedimiento 1: Estimulación de Células T de
sangre total
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

A 50μl de sangre Se agrego a la Se incubo de 5-24 Las células rojas


heparinizada se sangre hrs, durante las se lisaron con
previamente ultimas 5 horas se buffer de lisis y se
le agrego 1ml diluida 100 ng/ml agrego 3mM de fijaron con PAF 4%
RPMI 1640 para PMA y 2 μg/ml monensis para dejándolas listas
una dilución final ionomicina detener el para su marcaje
transporte de golgi posteriormente
(1:20)
Procedimiento 1M: Estimulación de monocitos de
sangre total
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

A 300 μl de Se agrego a la Se incubo 24 hrs, Las células rojas


sangre sangre con 3mM se lisaron con
previamente monensin para el buffer de lisis y se
heparinizada se diluida 10 mg/ml transporte de golgi fijaron con PAF 4%
le agrego 2 ml LPS dejándolas listas
RPMI 1640 para para su marcaje
posteriormente
una dilución final
(1:20)
Procedimiento 2: Estimulación de Células T en
PBMC’s
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

Aislamiento de Se agrego a la Se incubo de 5-24 Las células se


mononucleares por sangre hrs, durante las fijaron con PAF 4%
gradiente de Ficoll previamente ultimas 5 horas se dejándolas listas
, se resuspendio diluida 10 ng/ml agrego 3mM de para su marcaje
en RPMI y se llevo PMA y 2 μg/ml monensis para con anticuerpos
la concentración detener el posteriormente
ionomicina transporte de golgi
de cel/ml a 1.0x
106
Procedimiento 2M: Estimulación de Monocitos en
PBMC’s
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

A las células Se agrego a la Se incubo 24 hrs, Las células rojas


aisladas se les sangre con 3mM se lisaron con
previamente monensin para el buffer de lisis y se
puso en cultivo diluida 10 mg/ml transporte de golgi fijaron con PAF 4%
en RPMI 1640 LPS dejándolas listas
para su marcaje
posteriormente
Marcaje con anticuerpos:

Después de la fijación, las células fueron


lavadas 3 veces en PBS , se uso un
marcador de superficie para las células y
se re suspendieron en 200 \ mu l de Buffer
de permeabilización. Las células se
incubaron a temperatura ambiente durante
60 minutos ,se lavaron en PBS
Y sse re suspendieron en
paraformaldehído al 1,0% para análisis
Resultado 1:

La producción de IL-10
por monocitos se altera
en cultivo de sangre total.

Los datos muestran que para cada


donador ambas citocinas se expresaron
en porcentajes significativamente
mayores de células T (CD3 +) en los
cultivos de sangre total en comparación
con los cultivos de PBMC.
Resultado 4:

La producción de IL-10
por monocitos se altera
en cultivo de sangre total

Se encontró que la expresión media de


monocitos que secretan de IL-1a, IL-12 y
TNFa no se alteró entre PBMC y
condiciones de cultivo de sangre total.
Sin embargo, la expresión media de
monocitos de IL-10 fue
significativamente en el cultivo de sangre
total en comparación con el cultivo de
PBMC
Conclusión

• Breve resumen de lo que descubrió en base a los resultados

• Indique y explique si los datos confirman su hipótesis o no


Trabajos citados

• Incluya las fuentes impresas y electrónicas en orden alfabético