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HEMOGLOBINE

Physiologie - Hémolyse
Globules rouges
PRINCIPAUX CONSTITUANTS DU GLOBULE ROUGE

• Membrane érythrocytaire
- Bicouche phospholipidique
- Cholestérol
- Protéines : glycophorines, spectrine, actine, ankyrine …
- Importance du cytosquelette
- groupes sanguins
• Hémoglobine
- Structure tétramérique representant 95% des protéines
intracellulaires du GR
- 4 chaînes de globines (protéines) (140 AA)
2 paires de chaînes polypeptidiques
a, b ou d ou g
- Groupe prosthétique de l’hème
. Fer
. Protoporphyrine
Pigment coloré rouge
PRINCIPAUX CONSTITUANTS DU GLOBULE ROUGE

• Equipement enzymatique
Métabolisme énergétique
- Absence de mitochondries
- Voies glycolytique anaérobie

Glucose … Pyruvate lactate


ATP-dépendante, NAD-NADH
Pyruvate kinase (PK)

- Voie aérobie des pentoses phosphates

Shunt
NADPH dépendant
Glucose phosphate déshydrogénase (G6PD)
Globules rouges Numération sanguine : 4-6 .1012/L
Réticulocytes : 20-120. 1019/L

Morphologie : petite cellule anucléée VGM: 90fl

Equipement enzymatique :
-GGlycolyse :
Membrane = déformabilité Voie principale anaérobie
-BBicouche lipidique Pyruvate kinase
-PProtéine 3, glycophorine Shunt des pentoses
Glucose 6 phosphate deshydrogénase
NADPH
-CCytosquelette : spectrine,
2-3 Diphosphoglycérate
actine
Protéine 4.1, ankyrine
ATP = énergie
Hémoglobine
Echanges gazeux
Structure de l’hémoglobine

MM 64 kDa

2 paires de chaînes polypeptidiques


Contenant une porphyrine contenant un atome de FER
Structure quaternaire
de l’hémoglobine adulte A

a2b2
Structure de l’hème
(hémoglobine, myoglobine)

Protoporphyrine IX
tétrapyrrolique Histidine distale
FER FERREUX
O2

Histidine proximale
Evolution de la synthèse des chaînes
d’hémoglobine en fonction de l’âge
HbA
100
96-98 %

HbF <2%

HbA2
2-3,5 %
Différentes hémoglobines

Hémoglobine Période de la vie

A a2b2 Vie Adulte


A2 a2d2 Vie Adulte, (fœtale, néonatale)
F a2 g 2 Vie Fœtale, (fœtale,néonatale)
Gower 1 z2e2 Vie intrautérine précoce

Gower 2 a2e2 Vie intrautérine précoce

Portland 1 z2 g 2 Vie intrautérine précoce

Portland 2 z2b2 Vie intrautérine précoce


Gènes des globines

Région régulatrice
e g d b
5’ 3’
Chromosome 11

Région régulatrice z a2 a1
5’ 3’
Chromosome 16

Sens de la transcription
Gènes de globine

Bras p

5’ 3’

télomères

Au cours du développement
Synthèse de la chaîne b

Noyau

Transcription
Mitochondrie
Epissage
Ribosome
ARNm
Chaîne b

Hème

Chaîne a
ERYTHROPOIESE R-EPO R-TrF Hb

CFU-GEMM IL-3,IL-4,IL11 - + -
GM-CSF
BFU-E IL-3,IL-9 +/- + +/- Colonies très volumineuses 14-21 J
précoces GM-CSF Prolifération +++

BFU-E IL-3,IL-9 + + + Prolifération +


tardifs GM-CSF, EPO Différenciation induction synthèse d’Hb

CFU-E EPO +++ ++ + Colonies de moins de 50 cellules en 7


jours prolifération +/-
ProErythro EPO +++ ++ ++ Subira 4 divisions pour donner naissance
blastes de 8 à 32 GR en 5/6 J

Erythro EPO ++ ++ ++ Apparition de l’hémoglobine


basophile
Erythro +/- ++ ++
polychrom
Erythro - ++ ++ Ne se divise plus
acidophile
Réticulocytes - + + Perte du noyau
Coloration ARN

GR - - + Perte de l’ARN
Propriétés chimiques
 Fixation,transport et délivrance de
l’oxygène
 Egalement du CO2 et ions H+
 Forme T (tendu) de faible affinité et forme
R (relâché) de forte affinité
 Passage de la forme T à la forme R par
changement de conformation
Effet de l’oxygénation/déoxygénation sur la
structure quaternaire de l’hémoglobine

2,3 DPG

b2 b1

a2 a1
x

Structure déoxygénée Structure oxygénée


Courbes de dissociation de l’oxygène

HEMOGLOBINE
Courbes de dissociation de l’oxygène

Hb H, Hb Bart’s

Hb A, A2, F
Affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène

• Augmentation de • Diminution de l’affinité


l’affinité pour pour l’oxygène :
l’oxygène : – Fièvre
– Hypothermie – Acidose
– Alcalose – Augmentation de 2-3
– Diminution du 2-3 DPG
DPG – Fixation du CO2
Affinité de l’Hémoglobine F

Hémoglobine A Hémoglobine F
2,3 DPG

b2 b1 g2 g1
O2
a2 a1
x a2 a1
x

Mère Foetus
Fonctions de l’hémoglobine

• Transport de l’oxygène :
– Hème : transport (Fe++)
– Globine : hydrophobie, protection contre
l’oxydation
– Fe+++ : irréversible
• Transport du CO2 (10 %)
– Carbamation groupes N-terminaux
• Tampon
• Transport d’oxide nitrique (NO)
– Et effet « scavenger » : anti-oxydant
N.B : Modification post-synthèse GLYCOSYLATION HbA1C
Hémolyse physiologique
Définition
• Hémolyse = destruction physiologique des
GR au terme de leur vie évaluée à 120
jours
• 9 pour mille GR sont détruits par jour (=
50ml de sang environ )
HEMOLYSE PHYSIOLOGIQUE
• Durée de vie des GR :
- 120 jours
Mécanisme de la sénescence érythrocytaire
- Déficit énergétique
- Modification de la membrane
Augmentation de la méthémoglobine et de
l’affinité pour l’oxygène (déficit en 2-3 DPG)

• Modification des propriétés physiques,


rhéologiques (déformabilité) du GR

• Mécanismes de destruction des globules rouges


sénescents:fragmentation de la membrane, lyse
osmotique, phagocytose, cytolyse dépendant du
complément
CATABOLISME DE L’HEMOGLOBINE

Hème Bilirubine

albumine

Glycuro-conjugaison (foie)

Excrétion biliaire

Métabolisme rénal et intestinal


(systèmes bactériens)
Stercobilinogène (pigment brun)
Urobilines
SITES DE L’HEMOLYSE

• Extra-vasculaire (physiologique)
- (Foie, rate: faible)
- Système macrophagique de la moelle osseuse

• Intra-vasculaire (pathologique)
- Haptoglobine (a2), synthèse hépatique
- Complexes Hp-Hb (très forte affinité, irréversibles)
- Clairance hépatique des complexes (MM 150 000)
- Elimination urinaire de l’hémoglobine libre
(hémoglobinurie)
. Réabsorbtion tubulaire saturable
. Perte de fer
HEMOLYSE PATHOLOGIQUE

Durée de vie courte

Production médullaire Destruction

Régénération Hémoglobine,
Bilirubine

Anémie « régénérative »
INTERET CLINIQUE
• Comprendre la physiopathologie
- des anémies
- des anémies hémolytiques
(étiologies)

• Anémies hémolytiques du nouveau-né


• Transfusions érythrocytaires et
hémovigilance
BIOLOGIE

1. Argument formel direct - Durée de vie des GR


- Siège de destruction

2. Métabolisme de l’Hb - Haptoglobine


- Bilirubine libre
- Bilirubine glycuro-conjuguée
- Hémoglobinurie
- Hémoglobinémie

3. Métabolisme du fer - fer sérique


- ferritinémie

4. Anémie, régénérative- réticulocytose


5. Morphologie érythrocytaire, VGM, IDR
Analyse de l’hémoglobine
Électrophorèse de zone à pH alcalin (pH = 8,6)
Analyse de l’hémoglobine
Isoélectrofocalisation: fonction du pHi

Analyse de l’hémoglobine
Techniques électrophorétiques des chaînes
d'hémoglobine en milieu dissociant (HPLC)

Drépanocytose
hétérozygote AS

HbA1 = 58 %
HbS = 35,3 %
HbA2 = 4,7 %
Non Hb = 0,2 %
Analyse de l’hémoglobine
Techniques de biologie moléculaire

 Laboratoires spécialisés
 Diagnostic prénatal
 Epidémiologie
MORPHOLOGIE DES GLOBULES ROUGES

• Schizocytes Destruction mécanique


• Sphérocytes Anomalies de membrane
• Dacryocytes « mécanique », médullaire
• Cellules-cibles Hémoglobinopathies
• Drépanocytes Hémoglobine S
(gélification de l’Hb)
• Stomatocytes
• Elliptocytes
• Acanthocytes Anomalies de membrane
Frottis normal
anisocytose
macrocytose
Microcytes (brulures graves)
Double population
érythrocytaire
hypochromie
Hématies-cibles
polychromatophilie
Poïkilocytose
schizocytes
dacryocytes
Drépanocytose
ovalocytose
Corps de Jolly
Hématies ponctuées
Plasmodium
Agglutination des hématies
Hématies en rouleaux
Anomalie qualitative
(de structure)

 Anomalie de la chaîne de globine


  1050 variants  260 pr le gène α
 530 pr le gène β
 70 pr le gène γ
 Modification de la solubilité (Hb
S,C,D,E)
 Instabilité de la structure
 Modification de son affinité pour l’O2
Région régulatrice
e g d b

5’ 3’

Chromosome 11

z a2 a1
Région régulatrice

5’ 3’

Chromosome 16
Mutations :
- faux sens (exon) : Hémoglobine S, C, E
- introns/hors gène : certaines b thalassémies
Délétions :
- a thalassémies, certaines b/bd thalassémies
Drépanocytose
Mutation faux sens : gène de la chaîne b globine

Diminution de la
Solubilité de la forme
déoxygénée

Polymérisation de
l’hémoglobine

FALCIFORMATION
Drépanocytose

Frottis sanguin (MGG) Contraste de Phase

Polymérisation de l’HbS
Physiopathologie
(drépanocytose)
• Drépanocytose= état stable émaillé de
complications aigues de fréquence et de
sévérité variable d’un patient à l’autre

• Cinétique polymérisation dépend de [Hb]


intra-cellulaire, degré d’hypoxie, présence ou
pas d’Hb F
Epidémiologie-génétique
• Electivité ethnique +++ :
– Populations noires d’Afrique
(25 – 30 % porteurs du gène)
– Antilles (10 %)
– Bassin Méditerranéen
– Proche Orient
– Etats-Unis, puis Europe du Nord
Transmission mode autosomique
récessif
Double hétérozygotie : SC,Sbthal, SE
etc… fréquente
Diagnostic biologique
de la drépanocytose homozygote (1)

• Anémie ± profonde 70 à 90 g/l


• Normochrome, normocytaire
• Frottis: anisocytose, poïkilocytose,
corps de Jolly, drépanocytes,
érythroblastose
• Réticulocytose élevée
• Signes biologiques d’hémolyse
(frt,bilirubine,haptoglobine..)
Diagnostic biologique(2)

• Test de falciformation positif


• Test de solubilité (test d’Itano)
faible solubilité HbS désoxy.
• Diagnostic de certitude par 2 tests
- isoélectrofocalisation et -
électrophorèse sur agar à
pH acide, ou HPLC pour quantification
et identification HbA
absente, HbS 75 à 95%, HbA2 2 à
4%, HBF 1 à 15%
• Biologie moléculaire
Drépanocytose (S/S) :clinique
• Avant 3 mois: Hb F
• anémie hémolytique
– ictère
– splénomégalie ; atrophie splénique (asplénie)
• crises douloureuses vaso-occlusives (fièvre,altitude,
anesthésie, grossesse…)
• sensibilité aux infections (pneumocoque)
• manifestations viscérales
– Diagnostic à l’occasion d’une complication
aigue ou signe clinique particulier
– Dépistage néonatal +++
Dépistage néonatal en France

-Phénylcétonurie
- Hypothyroïdie
• Intégré aux autres
- Hyperplasie des
dépistages surrénales
- Drépanocytose
- Mucoviscidose
Diagnostic des doubles
hétérozygotes
• Autres syndromes drépanocytaires
majeurs(SDM)

• SβThal:anémie,microcytose
hypochromie, HbS, HbA présente ou
pas selon β° ou β+, HbF et HbA2

• SC: cellules cibles, HbS=HbC,HbF


Drépanocytose hétérozygote
• Non symptomatique
• Mais possibilité de complications avec
circonstances déclenchantes
• Dépistage systématique familial
• NFS normale, test de falciformation+
• Electrophorèse: HbA,HbS,HbA2
• Conseil génétique
Autres hémoglobinopathies
• Hb E (béta 26 glulys) Sud-Est asiatique (Kmers)
hétérozygote assymptomatique
homozygote : AH modérée svt bien tolérée
(microcytose)
• Hb C (béta 6 Glu Lys) Afrique haute Volta
bien tolérée chez hétérozygote A/C
• Hb D Punjab
• Hb O Arab (balkans)
• Variants asymptomatiques
• Hémoglobines instables (présence de corps
de Heinz)
polyglobulies
• Hémoglobines hyperaffines (haute
affinité pour l’oxygène)
• (normale de la P50= 26 mmHg à 37°C)

• DPG mutase
• (normale du 2-3DPG= 15µM/g Hb)

• Récepteur à l’EPO
Variations quantitatives

HbA2 ARNm d <<ARNm b HbF

• Diminution de l’HbA2 : • Augmentation de l’Hb


Carences en fer
F:
– Persistance
a/d et ad thalassémies
héréditaire de l’HbF
• Délétion des gènes d et
• Augmentation de b
l’HbA2 : - b-thalassémie
b thalassémies
Thalassémies:Epidémiologie
• Défaut de synthèse d’une ou plusieurs
chaines de globine (famille hétérogène)
• αThalassémies : Sud-Est asiatique
Afrique noire
bassin méditerranéen
Moyen Orient
• βThalassémies : bassin méditerranée
Sud-Est asiatique
• Mais répartition plus grande du fait des
migrations de populations
Diagnostic biologique βthal
homozygote

1. Electrophorèse de l’Hb
- HbF 50 à 95%
- HbA 5 à 45% pour β+thal
- HbA=0 pour β°thal
- HbA2 normale ou augmentée
Génétique: transmission
autosomique récessive(β thal)
1. Mutation ponctuelle
2. sur 1 gène β = βthal hétérozygote
3. sur 2 gènes β = βthal homozygote
β°thal si pas de chaîne produite
β+thal si diminution de synthèse
4. Rarement délétion β°thal
5. si délétion gène δ et γ = {β δ}thal
6. voir {β δ γ}thal
si délétion étendue = persistance
héréditaire Hb F(déficitβ compensé par γ)
7. Hb Lepore crossing over entre β et δ
α thalassémies

• α thalassémie • Microcytose ou
mineure pseudo-polyglobulie
• Perte 1 ou 2 gènes • Adulte:parfois
• Type 1 HbA2<2,5%
• Hb Bart’s Y4 à la • Diagnostic sur
naissance 1à2% ou antécédents
5% familiaux
• Asymptomatique
Génétique: alpha thalassémie
transmission autosomique
récessive(α thal)

– Délétion 2 gènes: α°thalassémie


(--/αα) hétérozygote
α+ thalassémie
(-α/-α) homozygote
– Délétion 1 gène: α+ thalassémie
(-α/αα) hétérozygote
– Délétion 3 gènes HbH β4
Hémoglobinose H (--/-α)
– Délétion 4 gènes: létale, anasarque
Hb Bart’s tétramère γ4
Hémolyses par anomalies
membranaires du globule rouge
• Sphérocytose héréditaire
• Elliptocytose héréditaire (mutations
chaînes de la spectrine ou protéine 4.1)
• Pyropoïkilocytose héréditaire (syndrome
hémolytique grave en période néonatale)
• Stomatocytose (anomalie d’un
transporteur membranaire ionique)
• Xérocytose héréditaire (anomalie
contrôle des cations monovalents)
Hémolyses par déficits
enzymatiques
• Anomalies de la voie d’Embden-
Meyerhof:
• Pyruvate kinase
• Glucose-phosphate isomérase
• Autres déficits avec atteinte d’autres systèmes
• Shunt des pentoses phosphates: G6PD
• Voie de synthèse du glutathion
Déficit en Pyruvate Kinase
• Epidémiologie: 1ère enzymopathie en
Europe
• Génétique: autosomique récessif
• Physiopathologie: déficit de synthèse
d’ATP inhibition de la pompe à sodium
• Clinique : AH chronique (parfois ictère
néonatal) splénomégalie
• Rares complications: lithiase pigmentaire
biliaire, hémochromatose
• Biologie: dosage de PK
Déficit en G6PD
• Epidémiologie: 5 à 25% Afrique sub-
saharienne, Asie tropicale, pourtour
méditerranéen, 10% noirs américains

• Génétique: récessif lié à l’X  hommes


2 gènes normaux A et B (si mutés: A- chez
noirs, méditerranéen dérive de B)

• Biochimie: le G6PD muté est incapable de


produire le NADPH nécessaire à la lutte
contre oxydants  dénaturation de l’Hb,
précipitation (corps de Heinz) , lyse
cellulaire
références
• Bonnes pratiques de l’étude de l’hémoglobine
• ABC 2003: 61; 401-409

• Prise en charge de la drépanocytose chez l’enfant et l’adolescent


(septembre 2005)
• http://www.has-sante.fr

• Référentiel « médicaments et déficit en G6PD » (25 février


2008)
• http://www.agmed.sante.gouv.fr

• Syndromes thalassémiques majeurs et intermédiaires (juin 2008)


• http://www.has-santé.fr