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Spectrométrie de Masse

Bases de la spectrométrie de Masse


Principaux modes d’ionisation

Pr Olivier Laprévote
olivier.laprevote@parisdescartes.fr

1
Principe de la Spectrométrie de Masse
Faible pression

Introduction Système de
Source d’ions Analyseur Détecteur
de traitement
l’échantillon M → M(+/-) M(+/-) →m/z m/z → I
des données

 3 étapes essentielles:
 Ionisation de l’échantillon
 Analyse des ions formés
 Détection du signal
Spectre de Masse
 Le spectre de Masse est un graphe en deux dimensions qui
indique les valeurs d’intensité (relatives ou absolues) en
fonction des valeurs de m/z

IA
Intensité

IB

IC

mC/z mB/z mA/z


Méthodes d’ionisation « directes »:
Ionisation électronique (IE)
 M+ e-  M +.
+ 2 e-

filament ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
70 V

électrons

+
repousseur + vers
+ l’analyseur
+
+ ions
molécules

V0
anode
(trappe)
Notion de potentiel d’ionisation
Ionisation Chimique (IC)
 Première étape: Ionisation d’un gaz réactif (exemple: l’ammoniac):
NH3 + e- → NH3+. + 2 e-
NH3+. + NH3 → NH4+ + NH2.

 Deuxième étape: protonation de la molécule M par l'ion ammonium


M + NH4+ → (M …..H….. NH3)+ → MH+ + NH3

m/z 18 m/z M+18 m/z M+1

 Lorsque l'on utilise un gaz réactif GH+, la réaction qui se produit avec la molécule M peut s'écrire de la
façon suivante:
M + GH+ → MH+ + G

GH+ → G + H+ ΔH°G = AP(G)


MH+ → M + H+ ΔH°M = AP(M)

 Les enthalpies de ces deux réactions s'appellent "affinités protoniques" (respectivement du gaz et de la
molécule à analyser); elles correspondent au terme enthalpique de la basicité en phase gazeuse.

 La réaction de protonation a lieu lorsque APG < APM

 Concrètement, on choisira un gaz réactif adapté à la molécule étudiée (de plus faible AP), en général
dans le but de limiter les phénomènes de fragmentation.
Echelle d’affinité protonique
Ionisation par désorption-désolvatation: MALDI
(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation)

IMSC, Bordeaux, 1988


MALDI: Principe
Processus MALDI et caractéristiques

 Mécanisme simplifié :

 Absorption linéaire de h par la matrice,


ionisation de la matrice

 Relaxation de l’énergie sous forme roto-


vibrationnelle et rupture des liaisons
intermoléculaires entraînant un changement de
phase rapide (< 10-10s)

 Transfert de charge aux molécules d’analyte

 Expansion supersonique dans le vide


(les molécules de matrice entraînant les
molécules plus lourdes d’analyte)

 Ionisation par transfert de proton et réactions


ion-molécule.
MALDI: cible et sas d’introduction
MALDI: cible réfrigérée (384 puits)
MALDI: Liste des principales Matrices

Matrice Nom courant PM  (nm)


1. Ac. 3-aminobenzoïque Ac. anthranilique 137,14 337, 355
2. Ac. 5-chlorosalicylique 172,57 337, 355

3. Ac. -cyano-4 hydroxycinnamique HCCA 189,20 337, 355

4. Ac. 2,5-dihydroxy-benzoïque 2,5-DHB 154,12 266, 337, 355

5. Ac. 3,5-diméthoxy-4 hydroxycinnamique Ac. Sinapinique (AS) 224,21 337, 355

6. Ac. 3-hydroxy picolinique 3-HPA 139,11 337, 355

7. Ac. 2-(4-hydroxy-phénylazo)benzoïque HABA 242,24 266, 337, 355

8. Ac. 9-nitroanthracène 9-NAC 222,23 337, 355


9. Ac. 5-nitrosalicylique 183,12 337, 355
10. Ac.3-pinacolique Ac. nicotinique 123,11 266
11. Ac.E-3-indole acrylique IAA 187,20 337, 355
12. 1,8-dihydroxy-9[10H]- anthracénone Dithranol (DT) 226,20 266, 337, 355
13. 2-nitrophényl octyl éther NPOE 251,33 337, 355
MALDI: Structures des principales Matrices
Cl CN
CO2H CO2H
HO CH C COOH
NH2 OH
1 2 3

HO CO2H CH CH CO2H OH

OH N CO2H
4 CH3O OCH3 5 6
OH
NO2
CO2H

N N OH

7 8

NO2 CO2H CO2H H CO2H


C C
OH N H
9 10 N 11
H

OH O OH OH
O(CH2)7CH3

NO2
HO OH

COCH3
12 13 14
MALDI: Préparation de l’échantillon
• méthode « standard » (dried droplet)
MALDI: Structures des principales Matrices

• 2,5 dihydroxy benzoïc acid


(DHB)
COOH
matrice adaptée pour les
peptides, les sucres, les OH
glycolipides, et les polymères
synthétiques;
C7H6O4, m/z 154.03. HO

 -cyano-4-hydroxy
cinnamic acid (HCCA)
Bonne matrice pour les
peptides et les protéines; CH C(CN)COOH
C10H7NO3, m/z 189.04.

HO
FAB (Fast-Atom Bombardment)
LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry)
Exemple de spectre de masse FAB

Impureté

Pic de matrice
Electronébulisation (Electrospray)

Premiers spectres ESI présentés par


John B. Fenn Fenn et col. en 1988 au congrès de l’ASMS.
Prix Nobel de Chimie 2002
Electronébulisation: Principe
Source d’ions par électronébulisation:
Schéma général
Electronébulisation: formation du nébulisat (spray)
Processus Electrospray

Lentilles de focalisation
Gaz nébuliseur
Contre-électrode

Cône de Taylor

+
+ ++ +
+ +
+
+ + +
- + + + +
+ +
+ + + +
+
+

Capillaire porté à un
haut potentiel
Gaz rideau
(N2, 80°C)
Exemple de spectre de protéine

10+75
7 7566

11+68
9

9+
842

8+
946
7+
1082

m/z
Source ESI « pepperpot » (Micromass)

5000 V 4000-4240 V 4000 V

8000 V N2

Ion intact

Capillaire Fragment

Sampling cone Skimmer


Contre-électrode

P atm. P intermédiaire (10-3 mbar) Vide

Schéma général de la source electrospray dite "pepperpot" (Micromass, Manchester, UK).


Effet de collision à l’interface: désolvatation et
activation par collision
H

N+
D transH+
C
N H
H H2N

H
H
H
N+
N H2N
N
N H
H H+
N cisH+
H
H

Effet de stéréochimie:

Spectre ESI à basse


énergie de collision
Effet de stéréochimie: Spectre ESI à énergie de collision élevée
Miniaturisation de la source electrospray: le nanospray
Source nanospray (Sciex)
Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique (APCI)
• L’APCI, procède de réactions ion-molécule en phase gazeuse à Patm.
• La solution est introduite en solution (50 mL à 1.5 mL/min) où elle est nébulisée l’aide
d’un courant d’azote.
• La désolvatation est favorisée par chauffage.
• Les ions sont produits par décharge électrique (électrons) sur l’aérosol de solvant
contenant l’échantillon.
• Les molécules sont ionisées chimiquement par transfert de proton en mode positif,
d’électron ou de proton en mode négatif.
• L ’ionisation est très efficace car elle se passe à Patm, où la fréquence des collisions
est élevée.
Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique
(APCI)

Exemples de spectres APCI


de 5 benzodiazépines. Conditions:
Débit : 1.2 mL/min dans un solvant
acétonitrile/méthanol/eau (40:25:35, v/v/v)
Photoionisation à pression atmosphérique
(APPI): principe

Ionisation à un photon dès lors que hν > PI


M + hν  M+. + e-

Energie interne < hν - PI


Eint ( M+.) = (hν - PI ) – E(e-)
Ionisation sélective
PI (eV)
Eau 12,62
Acétonitrile 12,20
Méthanol 10,84
Lampe au
Hexane 10,13
krypton: 10 eV (124
nm)
Heptane 9,93
Acétone 9,70
hc 9
= 10 Pyridine 9,26
Ee Toluène 8,83
E en eV Histidine 8,81
λ en nm
h=6,626.10-34 J.s
Phénylalanine 8,40
c=2,998.108 m.s-1 Tyrosine 8
e=1,602.10-19 C Tryptophane 7
Dessin de la source APPI (Sciex)

Expérience de Andries Bruins


Andries BRUINS
Carbamazépine et acridine: MH+

Andries BRUINS
Naphtalène et sulfure de diphényle: M+.

Andries BRUINS