Microorganismos Indicadores:

importancia y métodos de análisis

MERCK, S. A. - Gladys dríguez Page 2

CALIDAD DE LOS ALIMENTOS

• La prioridad en la

producción de los

alimentos es lograr y

garantizar su calidad.

• La calidad consiste en la

obtención de un producto

inocuo, que llene las

necesidades del

consumidor y produzca

satisfacción.
Page 3
INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

• Garantizar que no causen daño al

consumidor.

• Ausencia de microorganismos
patógenos o en los límites permitidos.

• Ausencia de toxinas, sustancias

tóxicas o en los limites permitidos.

• Ausencia de materia extraña.

Page 4
MICROORGANISMOS IMPORTANTES EN EL CONTROL
DE CALIDAD DE LOS ALIMENTOS

• Deterioro o descomposición
(DETERIORANTES)

• INDICADORES

• Transmisión de enfermedades

(PATOGENOS)

• Producción de alimentos y

bebidas fermentadas

Page 5
MICROORGANISMOS DETERIORANTES / PRODUCCION
PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS

• Causan cambios físicos desagradables

• Las bacterias y los hongos son los de mayor importancia.
• Atacan a los alimentos dependiendo de su actividad
bioquímica y adaptación:

CARBOHIDRATOS = SACAROLITICOS

GRASAS = LIPOLITICOS

PROTEINAS = PROTEOLITICOS

[AZUCAR] = OSMOFILICOS

[SAL] = HALOFILICOS

Page 6
OTROS CONTEOS PARA
PRODUCTOS ESPECIFICOS

• Conteo de acidófilos
• Conteo de esporoformadores
mesófilos
• Conteo de termodúricos
• Conteo de psicotróficos
• Conteo de halófilas

Page 7
BACTERIAS ACIDOFILAS O
ACIDO LACTICAS

• Crecen a pH ácidos (menores a 3.8 )

• Existen diversos géneros: Lactobacillus Leuconostoc,
Pediococcus
• Leuconostoc: Tolerancia a concentraciones elevadas de
sal y azúcar.
• Lactobacillus:
Utilidad en la producción de alimentos fermentados.
Algunos termoduricos, pueden resistir a la pasteurización.
Algunos crecen a temperaturas de refrigeración (carnes,
embutidos).

Page 8
BACTERIAS ESPOROFORMADORAS

• Existen diversas especies y la

mayoría son mesófilas, algunas
son termofilicas (crecen a
temperaturas de 45° C.)
• Por su resistencia al calor, tienen
importancia en alimentos que
reciben tratamientos térmicos
(enlatados, etc).
• Géneros principales: Bacillus
(aerobio) y Clostridium (anaerobio).

Page 9
TERMODURICOS 0 TERMORRESISTENTES

• Resisten tratamiento térmico

de pasteurización
• Tienen significado en
alimentos pasteurizados
(lácteos, cárnicos) .
• Se les relaciona con
deficiencias en limpieza del
equipo.
• Crecen pobremente a
temperaturas de
refrigeración.
Page 10
 BACTERIAS PSICROTROFICAS O
PSICROTROFAS

• Crecen a temperaturas de refrigeración

(Temp. óptima de 25° a 30° C).
• Son de importancia en alimentos
refrigerados no estériles.
• Metabolizan carbohidratos, proteínas
causando alteraciones en los alimentos.
• Algunos géneros: Pseudomonas,
Lactobacillus, Vibrio.
• Diversos mohos y levaduras.
• Incluyen algunos patógenos: Clostridium
perfringes, Vibrio cholerae, Listeria
monocytogenes, Salmonella, S. aureus.

Page 11
BACTERIAS HALOFILICAS O HALOFILAS

• Necesitan para crecer determinadas concentraciones de sal.

• Diversos grados de tolerancia a la sal.

• Incluyen diversos géneros de bacterias, mohos y levaduras.

• Las que pueden crecer en ausencia o presencia de determinadas

concentraciones de sal, se les denomina halotolerantes.

Page 12
ORGANISMOS INDICADORES

• Son especies o grupos de microorganismos,

principalmente bacterias y hongos.
• Indican si las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM)
e higiene han sido eficientes.
• Un número elevado indica un riesgo potencial de la
presencia de patógenos.
• Afectan la vida de anaquel del producto.

Page 13
INDICADORES COMUNES

• Conteo Aeróbico en Placa (PCA)

• Conteo de Levadura y Mohos

• Coliformes

• Escherichia coli

Page 14
 CONTEO AEROBICO EN PLACA

• Determina principalmente la carga

bacteriana, sin hacer diferencia de
ningún grupo en particular.
• Se aplica en la mayoría de alimentos, a
excepción de los productos donde se
utilizan cultivos en su proceso.
• Se utiliza el agar PCA (Plate Count Agar)
• Temperatura de incubación de 35°C para
la mayoría de alimentos.

Page 15
LAS LEVADURAS

• Crecen mejor a pH ácidos y en

sustratos con elevadas
concentraciones de sal o
azúcar.

• Deterioran principalmente
alimentos tales como:
Zumos de frutas
Jarabes
Melazas
Carnes
y productos fermentados.

Page 16
CONTEO DE LEVADURAS Y MOHOS

•Se aplica principalmente en alimentos de:

Bajo contenido de agua
Productos de baja acidez
Alta concentración de azúcar
•Un conteo elevado en un alimento procesado indica un
proceso de eliminación deficiente o contaminación post-
proceso.

•Un conteo elevado de mohos es un riesgo para la salud

cuando son productores de micotoxinas

•Algunas veces se observa crecimiento visual de hongos en

alimentos: rupturas, limosidad, crecimiento algodonoso
Page 17
CONTEO DE LEVADURAS Y MOHOS

•Los medios de cultivo

ayudan a su desarrollo e
inhiben el crecimiento de la
mayoría de bacterias:
•Agar Papa Dextrosa (PDA)
acidificado con 10 % de acido
tartárico
•Agar con
antibióticos:Cloranfenicol y/o
Clorotetracicilina 100 mcg/mL
de medio
•Las placas se incuban
durante 5 días a temperatura
de 22-25°C
Page 18
COLIFORMES (COLIFORMES TOTALES O
GRUPO COLIFORME)

•Bacilos Gram negativo, aeróbicos o anaerobios facultativos.

•Crecen en presencia de sales biliares
•Fermentan la lactosa con producción de gas a 35 -37 C
•La mayoría presentes en número elevado en el tracto
intestinal de humanos y animales de sangre caliente.
•Son excretados en millones por gramo de heces
•Algunas especies se encuentran en forma natural en otros
ambientes: vegetación, suelos y granos
•Su presencia es indicadora de higiene en alimentos
procesados
Page 19
COLIFORMES

Géneros de Enterobacterias:

Escherichia
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
Serratia

Page 20
COLIFORMES FECALES O
TERMORRESISTENTES

•Se diferencian del resto de coliformes por que también

fermentan la lactosa a 44.5 - 45.5 C
•Se consideran indicadores más específicos de
contaminación fecal.
•Incluyen a Escherichia coli y otras especies cercanas
•Los límites permitidos dependen del tipo de alimento.

Page 21
ESCHERICHIA COLI

• Es el indicador más preciso de

contaminación fecal, indica
contaminación fecal directa o
indirecta.
• Su único habitat es el tracto
gastrointestinal y se excreta en
millones por gramo de heces.
• No se acepta en productos
procesados.
• Algunas cepas son patógenas
(diarrea).
Page 22
MICROORGANISMOS / PATÓGENOS -
ALIMENTOS

• Causan enfermedades transmitidas por

alimentos / ETA.
• Causan en su mayoría enfermedades
gastrointestinales.
• Se multiplican en los alimentos y/o el
alimento, puede actuar como vehículo de
transmisión.
• Diferentes mecanismos de producir
enfermedad.
• Causan Intoxicaciones o Infecciones.
Page 23
Seguridad alimentaria: epidemias y
productos involucrados

Epidemias debidas a alimentos y cosméticos contaminados en

EEUU (10/93 - 9/98) (Wong et al. J. Food Prot. 63, 2000)

total: 1,330 casos

Producto: # incidentes: Microorganismo detectado: # de casos:

Leche 304 L. monocytogenes 813
Mariscos 157 Salmonella 143
Panadería 147 Staph. aureus 69
Ensalada 126 C. botulinum 38
Sandwich 124 Coliformes (no E.coli O157) 36
Dip/Salsa 108 E.coli O157:H7 16
Bebidas 94 Pseudomonas (en cosméticos) 25
Vegetales 81 Virus (Hepatitis A) 94
Cosméticos 56 Hongos/Levaduras 96 Page 24
Número estimado de infecciones causadas por
bacterias patógenas en USA 1999

# de infecciones: # casos letales:

Campylobacter 2.5 Mio 99

Salmonella 1.4 Mio 553
Shigella 450,000 14
Clostr. perfringens 250,000 7
Staph. aureus 185,000 2
E. coli O157:H7 96,000 52
Yers. enterocolitica 73,000 2
Bacillus cereus 51,000 0
Vibrio 8,000 31
Listeria monocytogenes 2,500 499
Page 25
SALMONELLA sp. (SALMONELOSIS)

• Enterocolitis aguda (dolor abdominal, diarrea, nausea ,

vómitos, fiebre).
• Reservorio: animales domésticos y salvajes, portadores.
• Período de incubación: 6-72 horas
• Dosis infectiva: 100 a 1000 células
• Transmisión: alimentos contaminados de origen animal y
otros.
• Fiebre tifoidea (S. typhi)
• Reversorio: hombre
• Agua y vegetales y frutas contaminadas con heces de
personas enfermas.

Page 26
 LISTERIOSIS (Listeria monocytógenes)

• Psicotolerante, sobrevive a altas

concentraciones de sal.
• Puede permanecer en diversos ambientes
( suelo, desagües, tuberías).
• Personas afectadas: mujeres embarazadas,
niños recién nacidos y personas con
deficiencias inmunológicas.
• Enfermedad: encefalitis, meningitis,
septicemia y aborto.
• Provoca una alta mortalidad: >25%
• Alimentos : (lácteos, vegetales, alimentos
procesados).

Page 27
ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENICA

•ECET (E. coli enterotoxigenica), se asocia

con diarrea del viajero.
•ECET (E. coli enteropatógena), diarrea en
niños <dos años.
•ECET (E. coli enterohemorrágica), causa
colitis o colitis hemorragica.

Page 28
De donde vienen las ECET ?

• Escherichia coli es una bacteria presente en la naturaleza, normalmente

se encuentra en el intestino de seres humanos y animales sanos. Sin
embargo, existen algunas variaciones o cepas que son patógenas
(tienen la capacidad de causar enfermedades).

• Escherichia coli 0157:H7 es una cepa particular que puede producir

infección gastrointestinal, cuyos síntomas como diarrea con sangre y
dolores abdominales, pueden o no aparecer.

• Los ancianos y los niños menores de cinco años son altamentes

susceptibles al Síndrome Urémico Hemolítico, enfermedad en la que
hay destrucción de glóbulos rojos y fallo renal.

• 3-10 % de mortalidad, 4 a 30 % de casos ocurren daños crónicos.

Page 29
 ESCHERICHIA COLI O:157 H: 7
(COLITIS ENTEROHEMORRAGICA)

• El CDC (Centers for Disease Control and Prevention) de los Estados

Unidos dice que, aproximadamente 10,000 a 20,000 personas en los
Estados Unidos son afectados anualmente, incluyendo 500 muertes
(Reed & Kaplan, 1996). Los brotes más frecuentes de E. coli 0157:H7
están asociados en rastros, con carnes con contaminación fecal.
Sin embargo, también se puede asociar con:
• agua
• leche cruda
• jugo de manzana no pasteurizado
• sandwiches
• lechuga
• salami
• yogurt
• carne mal cocida (HAMBURGUESAS!!!!!)

Page 30
Método Rápido Inmunológico para
Campylobacter
MERCK, S. A. - Gladys dríguez Page 31
 Campylobacter: Patógeno emergente

• Encontrado en pájaros, animales salvajes y domésticos

• C. jejuni y C. coli causan fiebre y gastroenteritis

• Duración: 2 - 4 días; período de incubación: 1 - 7 días

• 1/1,000 pacientes desarrollan Síndrome de Guilian Barré
(Parálisis por semanas o meses)

• Las infecciones resultan del consumo de alimentos contaminados como pollo,

productos lácteos sin pasteurizar
• Crece en condiciones microaerofílicas (difícil de cultivar en el laboratorio)

• Problema: muchos laboratorios no son capaces de detectar Campylobacter en

alimentos,por desconocimiento del manejo de este patógeno

Page 32
Bacillus cereus: Características

• Gram-positivo, esporoformador, móvil

• Células grandes: 3-5 μm de largo y 1.0-1.2
μm de ancho
• Aeróbico, pero también crece
anaeróbicamente
• Tiene una amplia variedad de habilidades
fisiológicas, que le permiten vivir en
cualquier ambiente natural
• Cepas psicotolerantes pueden crecer a
4-6°C

Page 33
Bacillus cereus

1. Síndrome Diarreico:
• incubación – 6 a 15 horas
• dolor abdominal, diarrea acuosa, nausea
ocasional
• productos cárnicos, sopas, leche, productos
lácteos, vegetales, pudines y salsas

2. Síndrome Emético:
• incubación – 0.5 a 6 horas
• nausea, vómitos y diarrea ocasional
• recuperación en 24 horas

• arroz, pasta, fideos,pasteles, productos de

almidón

Page 34
Staphylococcus aureus
INTOXICACION ESTAFILOCOCCICA

• Enterotoxina producida por algunas

cepas de Staphylococcus aureus en el
alimento.
• Síntomas: principalmente vómitos,
diarrea.
• Se encuentra formando parte de la flora
normal de la piel y mucosas de la
nasofaringe.
• Para producirse, la toxina necesita de
uno a diez millones de células.
• Alimentos de alto contenido proteico:
carnes, embutidos, productos lácteos.
• La enterotoxina estafilococcica es
termoestable.

Page 35
Clostridium perfringes

• Gastroenteritis por enterotoxina que se produce al

colonizar el intestino.
• Síntomas: dolores abdominales, diarrea.
• Distribuido en el ambiente.
• Dosis infectiva: un millón de células/g. del alimento.
• Período incubación de 7 a 15 horas.
• Carnes cocidas y productos de pollo contaminados y
dejados a temperatura ambiente.

Page 36
ESPECIES DE VIBRIOS

a. V. cholerae ---serotipo O1 y O139 productor de toxina

colérica
Causa el cólera (diarrea con deshidratación severa)
Dósis infectiva: 100,000 a un millón de células
Alimentos: agua, alimentos marinos crudos mal cocinados
y vegetales.
b. V. parahaemolyticus
Gastroenteritis
dosis infectiva: un millón de células / g del alimento
Alimento: alimentos marinos que se consumen crudos o
mal cocinados
c. V. vulnificus: Septicemia, dermatitis de contacto,
principalmente por consumo de ostras contaminadas y
otros alimentos marinos.

Page 37
TECNICAS DE SIEMBRA DE DILUCIONES

•Generalmente se siembran
alicuotas de 1 ó 0.1 mL

•La técnica de sembrado y

el medio a utilizar
dependen del organismo a
investigar.

•Generalmente se hacen
siembras en duplicado

Page 38
VACIADO EN PLACA “POUR PLATE”

•Se deposita la alícuota en la caja de petri

•Se adiciona el agar (baño de maría a 44-46°C )
•Se homogeniza la alícuota en el agar y se deja solidificar

Page 39
ESPARCIDO EN SUPERFICIE
“SPREAD PLATE”

•La alícuota se deposita

sobre la superficie del
agar ya solidificado

•Se distribuye
homogéneamente sobre el
agar (asa o varilla en L)

Page 40
FILTRACION CON MEMBRANA

• Se necesita de una unidad de filtración + equipo de succión

• Se usan membranas de filtración de una porosidad
conocida en micras.
• Permite el paso de los líquidos y los microorganismos
quedan retenidos en la membrana.

•La porosidad de la membrana depende de los

microorganismos a investigar. Ejemplo:
Coliformes ----------------------0.45 micras
Mohos y levaduras---------- 5.0 micras
Page 41
FILTRACION CON MEMBRANA

• Se utiliza especialmente para

productos líquidos.
• La membrana se siembra en el
medio adecuado.
• Después de la incubación se
obtiene crecimiento de las
colonias sobre la membrana.
• Las colonias se cuentan y se
informan en UFC/ ml o por el
volumen filtrado.

Page 42
NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

• El NMP o método de fermentación de tubos múltiples

• Es especialmente útil en muestras con baja concentración

de coliformes o en alimentos procesados donde pueden
haber sufrido daño celular

• Diluciones decimales sucesivas, se siembran de cada una

de 3 a 5 tubos de un caldo de cultivo
• Tomando en cuenta el número de tubos positivos se obtiene
un índice de NMP (tablas de estimaciones estadísticas)

• Con el NMP se obtiene un estimado de la población total de

coliformes y no identifica a especies en particular
Page 43
PRUEBA PRESUNTIVA

• Por cada dilución se siembran 3 tubos

de caldo Lauril-Sulfato-Triptosa LST
con 1 mL c/u.

• Incube los tubos 24-48 horas a 35 ±

1°C.

• Lectura positiva: presencia gas

(desplazamiento del líquido en la
campana Durham) o efervescencia
cuando el tubo es agitado.
• Agite y siembre una asada de cada
tubo de caldo LTS positivo para los
medios de cultivos de las pruebas de
confirmación:
Page 44
PRUEBA DE CONFIRMACION
GRUPO COLIFORME

• Se siembra a caldo BVB y

se incuba durante 24 - 48
horas a 35 ± 1°C

• Se anota el número de
tubos positivos de BVBL y
se calcula el índice del NMP
con base a la tabla de NMP

Page 45
PRUEBA DE CONFIRMACION
COLIFORMES FECALES

• Cada tubo positivo de la

prueba presuntiva se
siembra a caldo EC e
incubación por 24 - 48
horas a 45.5 ± 0.2°C en
baño de maría

• Se anota el número de
tubos positivos de EC y se
calcula el índice del NMP
con base a la tabla de NMP

Page 46
PRUEBA DE CONFIRMACION
ESCHERICHIA COLI

•Aislamiento a un agar
para observación de
colonias (L-EMB, MK,
Chromocult o BRV)

•Pruebas bioquímicas:
IMViC
Indol - Rojo de Metilo
Voges Proskauer
Citratos
Page 47
PRUEBA DE CONFIRMACION
ESCHERICHIA COLI

Page 48
Transformación de Lactosa a Galactosa y Glucosa
Lactosa
Membrana
Permeasa (energía dependiente)

CH OH
2

Lactosa O OH
CH OH
2 OH

HO O O OH
OH

OH
H 2O

ß - Galactosidasa

Galactosa Glucosa Page 49

Lactosa -

Lactosa+

Page 50
• Todos los métodos tradicionales requieren varios días (
3-5 ) antes de obtener resultados finales
• No es posible la diferenciación inicial
entre E. coli y
Coliformes Totales

Page 51
 Chromocult & Fluorocult

• Substratos Cromogénicos y Fluorogénicos

– Un nuevo instrumento en Microbiología Analítica

Page 52
 Escherichia coli
4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide
Glucuronidasa (MUG)
= ENZIMA Incoloro
Glucurónido
= Carbohidrato Methyl-
umbelliferon

)
0 nm Fluorescencia
(3 6 -lig ht
UV

Page 53
Chromocult & Fluorocult

Page 54
Page 55
 Detección de Coliformes y E. coli
Método Standard Método con Fluorescencia
Caldo Laurilsulfato
Caldo Laurilsulfato Fluorocult
35 - 37°C
35 - 37°C
24 - 48 h
24 - 48 h
Formación de gas
Coliformes Totales Formación de gas +
Fluorescencia Positivo
Caldo BRILA
Indol Positivo
45°C
24 - 48 h Coliformes y E. coli
Formación de gas (24 - 48 h)

Agar EMB
45°C
24 h
Brillo metálico

IMVIC (Confirmación de E.coli)

Indol +, RM + , VP - , Citrato -
Fluorocult® Caldo Lauril Sulfato
NMP
Tubos multiples con 10 ml Fluorocult
caldo LTS a simple concentración
1, 0.1, 0.01 ml muestra 37°C

1 Día

Prueba de
indol con
Kovac’s
Negativo Gas +
Sin formación de gas Coliformes Totales Fluorescencia: E.Coli

Page 57
Chromocult & Fluorocult

Composición Típica (g/litro)

Caldo
Caldo
Ingredientes Laurilsulfato
Laurilsulfato
Fluorocult
Triptosa 20,0 20,0
Lactosa 5,0 5,0
Cloruro de sodio 5,0 5,0
Laurilsulfato de Sodio 0,1 0,1
di-Potasiohidrogenefosfato 2,75 2,75
Potasiodihidrogenefosfato 2,75 2,75
L-Triptofano - 1,0
4-Metilumbeliferil-ß-D- - 0,1
glucuronido
Page 58
 Fluorocult® Caldo Lauril sulfato

Cepas Formación B-D- Indol

gas Gluc
Escherichia coli ATCC 25922 + + +
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 + - -
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 + - -
mixture of Escherichia coli ATCC 25922 and + + +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
mixture of Escherichia coli ATCC 25922 and + + +
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Staphylococcus aureus ATCC 6538_p - - -
Bacillus cereus ATCC 11778 - - -
Literature
• SCHINDLER, P.R.G.: MUG-Laurylsulfat-Bouillon - ein optimales Nachweismedium für gesamtcoliforme und fäkalcoliforme Bakterien im Rahmen der
hygienischen Überprüfung von Badegewässer gemäß der EG-Richtlinie 76/160 EWG. - Zbl. Hyg., 191; 438-444 (1991).

• Bundesgesundheitsamt: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG. - Beuth Verlag Berlin, Köln.

• DIN Deutsches Institut für Normung e.V.: Mikrobiologische Milchuntersuchung. Bestimmung der Escherichia coli. Fluoreszenzoptisches Verfahren
mit paralleler Bestimmung coliformer Keime. DIN 10183.

• ISO/DIS 11886 - 2 (1997): Milk and milk products; Enumeration of presumptive E. coli-MPN technique using MUG. New Zealand Dairy Industry:
Microbiological Methods Manual, Section 48: Product Test Methods-Enteric Indicator Organisms. - NZTM2; 48.5.1-48.5.10 (1998).

• Mikrobiologische Untersuchungsverfahren von Badegewässern nach Badegewässerrichtlinie 76/160/EWG: Nachweismethoden für fäkalcoliforme (E.
coli) und gesamtcoliforme Bakterien. - Bundesgesundheitsblatt, 10; 385-396 (1995).
Page 59
CALDO BRILA FLUOROCULT

E. coli MUG + Coliformes GAS +

Page 60
Page 61
Chromocult & Fluorocult

Agar Fluorocult E.coli-Directo

Page 62
 Chromocult & FLuorocult

• Fluorocult E.coli 0157 / Agar SMAC-CT

Page 63
 Chromocult & Fluorocult

Substratos Flurogénicos
VENTAJAS:
• Soluble en agua
• Estable al calor
• Alta sensibilidad
• Alta especificidad
• Ningún riesgo a la salud
• Métodos aprobados (ISO, FDA)

Page 64
Chromocult & Fluorocult

Substratos Flurogénicos
LIMITACIONES:
• Necesita luz UV

• Depende del pH

• Fuerte difusión

Page 65
 Substratos Cromogénicos
varios colores con substratos indolyl
REACCION GENERAL DE LOS SUBSTRATOS INDOLYL

CARBO INDOLYL
HIDRATO
ENZIMA

+
02
COLOR

Page 67
 Chromocult & Fluorocult

• Substratos Cromogénicos

• E.coli
• Coliformes Totales
• Enterococci
• Salmonella
• Listeria

Page 68
Chromocult & Fluorocult

AGAR Chromocult COLIFORMES

Page 69
 Chromocult & Fluorocult

AGAR Chromocult COLIFORMES

Un nuevo medio de cultivo

para la detección
simultánea de
Coliformes y E.coli.

Page 70
 COLIFORMES
6-CHLORO-3-INDOLYL-ß-D-GALACTOPYRANOSIDE

(SALMON-GAL)

GALACTOSIDASA
GALACTOSIDO
= ENZIMA
=CARBOHIDRATO
INDOLYL

+
O2
CLOROINDIGO

Page 71
 E. coli
5-Bromo-4-CHLORO-3-INDOXYL-ß-D-GLUCURONIDE
(X-GLUC)

GLUCURONIDASA
GLUCURONIDO
= ENZIMA
=CARBOHIDRATO
INDOLYL

+
O2
BROMOCLOROINDIGO

Page 72
 E. coli y Coliformes
X-GLUC y Salmon-GAL
Glucuronidasa
y Galactosidasa Glucuronido
y Incoloro
= Enzimas Galactosido
=Carbohidrato Indolyl

+
O22
Cloroindigo Bromocloroindigo

Coliformes E.coli
y E.coli E.coli
Agar Chromocult para Coliformes

2 SUBSTRATOS CROMOGÉNICOS

1. COLOR ROJO
BETA-Galactosidasa

2. COLOR AZUL
BETA-Glucoronidasa
Page 74
Agar Chromocult para Coliformes

Interpretación de Resultados:
Coliformes totales: Colonias salmón/rojo y
azul oscuro/violeta.

Escherichia coli: Colonias azul oscuro/

violeta.
Otras Enterobacteriaceae: Colonias incoloras,
excepto algunas del género Salmonella que
poseen actividad de beta-D-Glucuronidasa.
Estas colonias aparecen azul claro o turquesa.

Page 75
Procedimiento Chromocult Coliformes
Recuento en placa .

0.1 ml Muestra
18 - 24 h / 35-37°C

Prueba de
1 Día indol con
Kovac’s

Positivo Positivo

Rojas: Coliformes Violetas: E.Coli

Page 76
AGAR CHROMOCULT

Page 77
AGAR CHROMOCULT

Page 78
Chromocult COLIFORM Agar vs. VRB Agar

No hay diferenciación

Page 79
Chromocult & Fluorocult

Agar Chromocult TBX

Page 80
CALDO CHROMOCULT ENTEROCOCCI

ENTEROCOCCI NEGATIVO BLANCO

Page 81
PRUEBA DE ENTEROCOCCI EN AGUA

Readycult Enterococci 100

Page 82
 Chromocult & Fluorocult

RAMBACH AGAR

• Agar Cromogénico
para Salmonella

Page 83
Page 84
AGAR RAMBACH

Page 85
AGAR RAMBACH

Page 86
Agar Chromocult ALOA acc. a la Norma ISO

Listeria spp. Listeria monocytogenes.

X-Glucosida

Page 87
 Chromocult & Fluorocult

Substratos Cromogénicos
VENTAJAS:
• Soluble en agua
• Estable al calor
• No / debil difusión
• No depende del pH
• No es dañino
• Coloración estable

Page 88
MEDIOS FLUOROGENICOS QUE
COMBINAN UN SUSTRATO
CROMOGENICO

MERCK, S. A. - Gladys dríguez Page 89

 Substratos Fluorogénicos
Merck : Fluorocult ®
Glucuronidasa
= ENZIMA Incoloro
E. coli Glucuronido
= Carbohidrato
4-Metil-
umbeliferil
MUG

Fluorescencia
 Coliformes
5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside (X-GAL)
Galactosidasa
= Enzima Incoloro
Galactosida
=Carbohidrato
Indol

Incoloro

+
O 2

Bromocloroindigo
Fluorocult® Caldo LMX Coliformes
modificado por MANAFI & OSSMER .
NMP
Tubos multiples con 10 ml Fluorocult
Caldo LMX a simple concentración
1, 0.1, 0.01 ml muestra a 35°C

1 Día

Cambio de Color Prueba de

indol con
Sin Cambio color Positivo Kovac’s
Negativo Verdes
Fluorescencia: E.Coli
Otras bacteria Gram - Coliformes Totales

Page 92
Chromocult & Fluorocult

Page 93
 Chromocult & Fluorocult

Caldo Fluorocult LMX - Prueba de Presencia/Ausencia

Page 94
Principio de las Pruebas de Flujo Lateral

anticuerpo

bacteria
Partículas de oro

membrana
Page 95
Procedimiento General de las Pruebas Rápidas

Page 96
 Prueba Rápida Immunológica
Singlepath® Salmonella para la Detección de Salmonella en
Alimentos

25 g/ml de muestra
Día
en 225 ml Agua Peptonada
1
35-37 °C por 16-20 h

sólo 0.1 ml AP a 9.9 ml Caldo RVS sólo

Día
2 2 días 42°C por 24 h
Calentar por 15 min a 95°C
2
medios
NO SI
Salmonella Salmonella
Día
3 presente presente

Día SEMBRAR
Si es positivo, se requiere confirmación por EN RAMBACH
4 cultivo y pruebas bioquímicas 37 °C POR 24 h

Page 97
 Estándares ISO y FDA-BAM para el análisis de
E.coli 0157 en Alimentos – 8 ó 24 horas

Día
25 g/ml MUESTRA 25 g/ml MUESTRA
1
225 ml en m-TSB 225 ml m-EC o m-TSB
37 °C por 8 h 37 °C por 24 h

Día Sorbitol (+)

2 E.coli
no
patógena

Agar CT-SMAC 37°C / 24 h Agar Fluorocult E.coli 0157

Día Se requiere confirmación por cultivo y pruebas bioquímicas
3
Page 98
Prueba Rápida Immunológica usando Singlepath®
E. coli 0157 para la Detección de E. coli 0157 en Alimentos

25 g/ml MUESTRA
Día en 225 ml mEC+N o mTSB+N
1 37- 42 °C por 24 h

No SI
E. coli 0157 E. coli 0157
Día presente presente
2
solo solo 1
8 horas medio

Día PLAQUEAR EN
Si es positivo, se requiere confirmación
Agar CT-SMAC
3 mediante cultivo y pruebas bioquímicas 37 °C por 24 h

Page 99
Confirmación de E. coli O157 usando
Singlepath® E. coli O157

Suspender 1-5 colonias

sospechosas en 250 µl PBS,
Pipetear 150 µl en Singlepath
Agar SMAC, CT-SMAC

No SI
E. coli 0157 E. coli 0157
presente presente

Page 100
Pruebas Rápidas de Merck:
pruebas para los patógenos más comunes

Listeria: Salmonella: E. coli O15: Campylobacter: Bacillus cereus:

Buff. LEB Agua Peptonada mEC + n Caldo Bolton Agar M.Y.P.
Fraser Rappaport.-Vas. mTSB + n Agar CCD Caldo CGY
Caldo BHI
UVM Selenito Cistina CT-SMAC
PALCAM Salmosyst
OXFORD Caldo M
Chromocult XLT4 , XLD,
Listeria Agar Rambach

Page 101
GRACIAS!

Page 102