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• Enzimas de restricción
ENZIMAS • Taq ADN polimerasa
• Ligasas
• Plásmidos
VECTORES • Virus
HERRRAMIENTAS: ENZIMAS DE
RESTRICCION
TAMAÑO DEL
VECTORES DE CLONACIÓN
INSERTO
Vectores plasmídicos con alto número de
copias de tipo estándar
0 a 10kb
Vectores de inserción del fago lambda 0 a 10kb
Vectores de reemplazamiento del fago lambda 9 a 23kb
Vectores cosmídicos 30 a 44kb
Bacteriófago P1 70 a 100kb
Vectores PAC (cromosomas artificiales de P1) 130 a 150kb
Vectores BAC (cromosomas artificiales de bacterias) hasta 300kb
Vectores YAC (cromosomas artificiales de levadura) 200 a 2000kb
pBR322
Ava I
Bal I
ori
ori
r
amp
Sna I Pvu II
1 2 3 4 5 6 (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18) 7 8
THR MET ILE THR ASN SER ser ser val pro gly asp pro leu glu ser thr cys arg ala ser leu ala LEU ALA
his
ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCA CTG GCC
Vectores derivados del fago lambda: (A) fago lambda de reemplazo. (B)
fago lambda de inserción. (C) cósmido
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Cósmidos Plásmidos con la secuencia cos del fago lambda.
Los cósmidos recombinantes son encapsula-dos en partículas
fágicas con capacidad infectiva y se replican como plásmidos
en el interior de las células hospedadoras.
cósmido
Tecnología del DNA recombinante:
Clonación: vectores y hospedadores
Cromosomas artificiales. Fragmentos de DNA de gran
longitud, de unas cuantas megabases: YAC, yeast artificial
chromosomes.
Secuencias eucarióticas necesarias para construir un YAC:
-Dos telómeros, para la replicación completa y para la
protección de los extremos de las moléculas de DNA lineales
-Un centrómero, para la correcta segregación de las
cromátidas hermanas durante la mitosis y de los
cromosomas homólogos en la meiosis
-Un origen de replicación o región autónoma de
replicación (ARS), para la replicación independiente del
cromosoma
También: marcador seleccionable y dianas de
restricción
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Otros tipos de cromosomas artificiales que se utilizan junto
con los YAC y los cósmidos para generar mapas físicos de
genomas son los BAC (“Bacterial Artificial Chromosomes”,
cromosomas bacterianos artificiales) y los PAC (“Phage P1-
based artificial chromosomes”, cromosomas artificiales
derivados del bacteriófago P1).
Estructura de un cromosoma artificial
bacteriano (BAC) utilizado para la
clonación de fragmentos de DNA grandes.
CMR es un marcador seleccionable de
resistencia al cloramfenicol. oriS, repE,
parA y parB son genes del plásmido F que
controlan la replicación y el número de
copias por célula. cosN es el lugar cos del
fago lambda. HindIII y BamHI son sitios
de clonación en los que se inserta el DNA
foráneo. Los dos promotores permiten
transcribir el fragmento insertado. Los
sitios NotI se utilizan para retirar el
fragmento insertado
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Vectores de expresión
Se caracterizan por disponer de un promotor muy activo y
en algunos casos regulable, que asegure la síntesis de la
proteína.
Los hospedadores
Las bacterias son los organismos más utilizados como receptores
del DNA recombinante, tanto por razones históricas como por las
ventajas que ofrece su uso.
Con respecto a los organismos eucariotas, la levadura es uno de
los más utilizados como hospedador del DNA recombinante,
debido a su facilidad de manipulación en el laboratorio, su rápido
crecimiento, la abundancia de mutantes disponibles y de vectores
para su transfor-mación, y el amplio conocimiento molecular que
se tiene de este organismo.
Genotecas: obtención y tipos
2
0
0
3
Genotecas
Genoma de
l'organisme
Fragmentació per
Método más común para
crear extrems
cohesius o roms
construir una genoteca genó-
mica: fraccionamiento del
DNA de partida con una
enzima de restricción y la Clonatge en fags
o cosmidis
clonación no selectiva de
todos los fragmentos obteni-
dos. Este método se denomina
método de la perdigonada. Amplificació i
aïllament del
vector en E. coli
GENOTECA
2
0
0
3
1
Inserción de un fragmento de
clonación
Plásmido
Plásmidos
gen de resistencia
a la ampicilina
2 3
Extremos cohesivos
• ADN molde
• Magnesio
• Termociclador
PCR: Reacción
en cadena de
la polimerasa
CARACTERÍSTICAS VARIANTES
• Rendimiento • “hot start” PCR
• Sensibilidad • RT-PCR
ADN enfermo
ADN complementario
del ADN enfermo
Conocimiento previo de
la secuencia de ADN DIAGNÓSTICO
enfermo
Si aparecen bandas
fluorescentes
demuestra que la
persona presenta la
Biochip anomalía
Microarray
¿Hibridación? Renaturalización Desnatura ADN de la
DNAchip
¿No hibridación? del ADN con la lización persona que se
sonda del ADN quiere
fluorescente diagnosticar
HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS:
SOUTHERN BLOT