ADN RECOMBINANTE

Dra. Elena Alvarado León

Depto. de Morfología Humana
DNA recombinante

DNA recombinante: asociación nueva entre

fragmentos de DNA que no se encuentran juntos
normalmente.

Propiedad básica del DNA :

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La

especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases
complementarias constituye un poderoso instrumento para la
identificación, aislamiento, clonación de fragmentos de DNA
complementarios.
 ETAPAS BÁSICAS PARA LA OBTENCIÓN DE ADN
RECOMBINANTE

Preparación del Unión del

Preparación del
inserto de ADN a fragmento de ADN
vector
clonar al vector

Propagación celular Introducción del

Análisis del gen y selección del clon ADN recombinante
clonado con el gen de en una célula
interés anfitriona
 HERRAMIENTAS DE LA TECNOLOGÍA
DEL ADN RECOMBINANTE

• Enzimas de restricción
ENZIMAS • Taq ADN polimerasa
• Ligasas

• Plásmidos
VECTORES • Virus
HERRRAMIENTAS: ENZIMAS DE
RESTRICCION

Descubiertas por W. Arber, H. Smith y Nathans a

fines de los 60

Reconocen secuencias específicas en el DNA de

doble cadena

Cortan ambas cadenas en lugares concretos

Reconocen secuencias específicas de 4-8 pares

de bases
 Tipos de enzimas de
restricción
Tipo I: Realizan corte y metilación, requieren de
ATP, cortan sitios aleatoriamente,distintos del
sitio de reconocimiento

Tipo II: Realizan corte, no requieren ATP, cortan

dentro del sitio de reconocimiento

Tipo III: Corte y metilación, utilizan ATP,cortan

sitios aleatorios cerca de los sitios de
reconocimiento
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores

Para conservar y propagar los fragmentos de DNA en el

interior de las células hospedadoras, es necesario emplear
unos vehículos que los transporten: vectores de
clonación.
Características:
-Capacidad para replicarse autónomamente en el
interior de las células hospedadoras
-Capacidad para aceptar fragmentos de ácido nucleico
heterólogo, el cual se propaga y mantiene junto al vector
-Poseen un marcador seleccionable que facilita la
identificación de las células dónde ha insertado
-Su recuperación de las células hospedadoras no ha de
implicar ninguna dificultad
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores

TAMAÑO DEL
VECTORES DE CLONACIÓN
INSERTO
Vectores plasmídicos con alto número de
copias de tipo estándar
0 a 10kb
Vectores de inserción del fago lambda 0 a 10kb
Vectores de reemplazamiento del fago lambda 9 a 23kb
Vectores cosmídicos 30 a 44kb
Bacteriófago P1 70 a 100kb
Vectores PAC (cromosomas artificiales de P1) 130 a 150kb
Vectores BAC (cromosomas artificiales de bacterias) hasta 300kb
Vectores YAC (cromosomas artificiales de levadura) 200 a 2000kb

Capacidad de clonación de los diferentes tipos de vectores

Los más utilizados: plásmidos, bacteriófagos,

cósmidos y los cromosomas artificiales de levadura
 Tecnología del DNA recombinante:
Clonación: vectores y hospedadores

Plásmidos: Moléculas circulares extracromosómicas de DNA

bicatenario, heredadas de manera estable durante las sucesivas
generaciones celulares. Los más utilizados son del tipo
multicopia.
EcoR I Cla I Hind III
(A) BamH I
Rru I Sph I
Pvu I Sal I
Pst I
Resistència
a ampicilina Resistència Xma III
a tetraciclina Nru I (B) lacZ' + MCS

pBR322
Ava I
Bal I

ori
ori
r
amp
Sna I Pvu II

1 2 3 4 5 6 (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18) 7 8
THR MET ILE THR ASN SER ser ser val pro gly asp pro leu glu ser thr cys arg ala ser leu ala LEU ALA
his
ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCA CTG GCC

EcoRI Sst I KpnI BamHI XbaI Sal I Pst I Sph I HindIII

Sma I Acc I
XmaI
HincI

(A) plásmido pBR322 (B) plásmido pUC: los plásmidos

pUC retiene el gen de resistencia a la ampicilina.
Clonación: vectores y hospedadores

Bacteriófagos Pueden actuar como

(A)
vehículos naturales en la R R R R
transducción de DNA bacteriano.
Fag  de reemplaçament
Los fagos modificados por
Insert de 20 kb

ingeniería genética pueden hacer (B) R R R

lo mismo a partir de cualquier tipo
Fag  d'inserció
de DNA. Los más conocidos
Insert de 5 kb
R
derivan del fago lambda de E. (C)
coli. Se dividen en vectores R R

lambda de inserción y de Insert de 45 kb

reemplazamiento o Cosmidi
sustitución.

Vectores derivados del fago lambda: (A) fago lambda de reemplazo. (B)
fago lambda de inserción. (C) cósmido
 Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Cósmidos Plásmidos con la secuencia cos del fago lambda.
Los cósmidos recombinantes son encapsula-dos en partículas
fágicas con capacidad infectiva y se replican como plásmidos
en el interior de las células hospedadoras.

cósmido
 Tecnología del DNA recombinante:
Clonación: vectores y hospedadores
Cromosomas artificiales. Fragmentos de DNA de gran
longitud, de unas cuantas megabases: YAC, yeast artificial
chromosomes.
Secuencias eucarióticas necesarias para construir un YAC:
-Dos telómeros, para la replicación completa y para la
protección de los extremos de las moléculas de DNA lineales
-Un centrómero, para la correcta segregación de las
cromátidas hermanas durante la mitosis y de los
cromosomas homólogos en la meiosis
-Un origen de replicación o región autónoma de
replicación (ARS), para la replicación independiente del
cromosoma
También: marcador seleccionable y dianas de
restricción
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Otros tipos de cromosomas artificiales que se utilizan junto
con los YAC y los cósmidos para generar mapas físicos de
genomas son los BAC (“Bacterial Artificial Chromosomes”,
cromosomas bacterianos artificiales) y los PAC (“Phage P1-
based artificial chromosomes”, cromosomas artificiales
derivados del bacteriófago P1).
Estructura de un cromosoma artificial
bacteriano (BAC) utilizado para la
clonación de fragmentos de DNA grandes.
CMR es un marcador seleccionable de
resistencia al cloramfenicol. oriS, repE,
parA y parB son genes del plásmido F que
controlan la replicación y el número de
copias por célula. cosN es el lugar cos del
fago lambda. HindIII y BamHI son sitios
de clonación en los que se inserta el DNA
foráneo. Los dos promotores permiten
transcribir el fragmento insertado. Los
sitios NotI se utilizan para retirar el
fragmento insertado
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores

Vectores de expresión
Se caracterizan por disponer de un promotor muy activo y
en algunos casos regulable, que asegure la síntesis de la
proteína.

El producto que se obtiene es muchas

veces una proteína de fusión porque,
además del producto del gen inser-
tado, presenta unos pocos amino-
ácidos extra en el extremo amino-
terminal, propios de la proteína del
hospedador

Vector de expresión de la serie pIN.

 Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores

Los hospedadores
Las bacterias son los organismos más utilizados como receptores
del DNA recombinante, tanto por razones históricas como por las
ventajas que ofrece su uso.
Con respecto a los organismos eucariotas, la levadura es uno de
los más utilizados como hospedador del DNA recombinante,
debido a su facilidad de manipulación en el laboratorio, su rápido
crecimiento, la abundancia de mutantes disponibles y de vectores
para su transfor-mación, y el amplio conocimiento molecular que
se tiene de este organismo.
 Genotecas: obtención y tipos

Las genotecas son colecciones de clones de DNA obtenidas a

partir de cierto DNA donador

Genoteca genómica: genoteca que comprende un genoma

completo
Genoteca de cDNA: genoteca compuesta de cDNA obtenido
a partir de los RNAm de un determinado tejido o tipo celular
Genoteca de expresión: genoteca realizada con un vector
que lleva señales adecuadas para provocar que cualquier
inserto de DNA clonado genere un mRNA y, en última
instancia, un producto proteico.

2
0
0
3
Genotecas
Genoma de
l'organisme

Fragmentació per
Método más común para
crear extrems
cohesius o roms
construir una genoteca genó-
mica: fraccionamiento del
DNA de partida con una
enzima de restricción y la Clonatge en fags
o cosmidis
clonación no selectiva de
todos los fragmentos obteni-
dos. Este método se denomina
método de la perdigonada. Amplificació i
aïllament del
vector en E. coli

GENOTECA

2
0
0
3
1
Inserción de un fragmento de
clonación

Plásmido
Plásmidos

gen de resistencia
a la ampicilina

2 3

Extremos cohesivos

Molécula de ADN recombinante

Plásmido

Introducción del vector

 Técnica de amplificación:PCR

• ADN molde

• ADN polimerasa termoestable

– Taq polimerasa de Thermus aquaticus

• Cebadores: Oligonucleótidos 10-20 pb

• Desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP,dTTP,dCTP,dGTP)

• Magnesio

• Termociclador
PCR: Reacción
en cadena de
la polimerasa
CARACTERÍSTICAS VARIANTES
• Rendimiento • “hot start” PCR

• Duración • PCR larga

• Especificidad • PCR anidada

• Sensibilidad • RT-PCR

• Fidelidad • PCR en tiempo real

 APLICACIONES
Mediante ingeniería genética
se construye una sonda de
ADN, marcada (marcaje
Diagnóstico de enfermedades de origen genético fluorescente), con la
secuencia complementaria del
ADN enfermo
ADN sano

ADN enfermo
ADN complementario
del ADN enfermo
Conocimiento previo de
la secuencia de ADN DIAGNÓSTICO
enfermo

Si aparecen bandas
fluorescentes
demuestra que la
persona presenta la
Biochip anomalía
Microarray
¿Hibridación? Renaturalización Desnatura ADN de la
DNAchip
¿No hibridación? del ADN con la lización persona que se
sonda del ADN quiere
fluorescente diagnosticar
 HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS:
SOUTHERN BLOT

 Proceso en el cual se hibridan 2 fragmentos de DNA.

 El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados
por electroforesis.
 Los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un
proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas
sencillas.
 El ADN inserto en el gel es transferido a una membrana de nitrocelulosa.
 Dicha membrana se incuba durante un tiempo con la sonda marcada para hibridar
a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy
parecida).
 La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar mediante
una radiografía para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la
luz, para el caso de sondas fluorescentes.
 HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS:
NORTHERN BLOT

Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al

ADN que se usa como sonda.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una
electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga
las cadenas de ARN en estado desnaturalizado.
El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern.
El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar
estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos
formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos
celulares.