 PRESENTADO POR:

 Sofía Garzón
 Lilibeth Palacios
 Karen Rengifo
 Angela Sierra
 Felipe Garzón
 Juan Celeita

Departamento de Biología
Fisiología Animal
 INTRODUCCIÓN
Cx35

Glutamato

Club ending: modelo para

el estudio de mecanismos
básicos eléctricos y
químicos

Tomado de Faber & Pereda, (2011)

 INTRODUCCIÓN

Tomado y modificado de Pereda et al., (2003; 2004)

ENDOCANABINOIDES:
mensajero difusible,
retrógrado y lipídico.
Regulan la fuerza de la
sinapsis

Estimula la supresión de la
transmisión sináptica por
mecanismos presinápticos
 Hipótesis
La activación de CB1R por
endocanabinoides genera la
depresión de la transmisión
sináptica
 Montaje experimental Figura 1

Respuesta de la
EPSP después de
la aplicación de un
baño WIN

Pre- tratamiento con

una combinación de
antagonistas AM +
SR. adición de WIN
Baño de
WIN

Aplicación de AM
+ SR, comprobar
Ambos componentes de la sinapsis se que no tenían efecto
ven potenciados por la activación de
los receptores cannabinoides
¿La aplicación local de WIN en las
inmediaciones de la dendrita en las
celulas M puede provocar
potenciación de la respuesta
sináptica?
Breve activation local del agonista CB1R, es Suficiente para desencadenar un potenciación mixta
Figura 2
Montaje experimental

Este se aplica
localmente
Se aumenta la extracelular,
respuesta sináptica cercano a los
local con WIN Club Endings

Con la aplicación local se

potencia la sinapsis mixta
Breve activation local del agonista CB1R, es Suficiente para desencadenar un potenciación mixta
Figura 2
Inmunohistoquimica

CB1Rs: (ROJO)
Marcador de
receptor
endoccannabinoide

Los CBR’s no se
encuentran en la
célula-M pero están
cerca a los Club
Endings Cx35:
(VERDE)
Marcador de los
Gap junctions
¿La potenciación generada por
la aplicación de WIN es
mediada por la liberación de
dopamina en las varicosidades
cercanas?
 La dopamina
La dopamina podríaen la
interviene
intervenir en la potenciación
potenciación de la Figura 3
de transmisión
la transmisión sináptica
sináptica
provocada por WIN en las
Club endings
Hay cercanía entre las
varicosidades y las Club
Endings

SCH-23390 es un
Misma vía Vía PKI es un inhibidor de PKA
distinta
Antagonista de D1/5
La liberación de los
endocanabinoides debe estar
en las proximidades de las
club endings
 Figura 4
4

Los mGlurR están

asociados la
liberación de
endocannabinoides

Receptores metabotrópicosde
glutamato mGluR1 se encuentran en
Polyclonal anti-mGluR1
Club endings y extra-sinápticamente
 Figura 4
Agonista de mGluR Despolarización

Liberación de
Endocannabinoides

Requiere la
activación de
mGluR y de
despolarización
para que se de la
potenciación
¿Los patrones de estimulación
del VIII nervio posterior podría
desencadenar una potenciación
a largo plazo de la respuesta
sináptica ?
 Actividad repetitiva de Respuesta Elétrica
es 4-5 > que la
100 Hz promueve la glutamatergica
liberación de
endocannabinoides

100 Hz Durante Antagonistas

1s×5 Liberación de endocannabinoides se da en la dendrita AM y SR de
lateral resultado de la actividad de Club Endings CBR1

THL SCH
Inhibidor de antagonista
DGL de D1/5
¿Es posible que la liberación
de dopamina se incremente
como resultado de la
supresión de la liberación de
GABA desde terminales
inhibidores cercanos?
 Figura 6
Des-Inhibición de la
sinapsis de GABA

Bicuculina
Antagonista
de GABA

No hay cambios significativos en la amplitud de los componentes del

EPSP mixto
 Determinación de la
colocalización de CB1Rs y
varicosidades dopaminergicas en
la dendrita lateral de la célula M
 Figura 7

Inmunomarcaje doble con Anti-CB1-CT

y TH (Anti-Tyrosina Hydroxylasa)

Se encontró
sobrelapamiento

La distribución obsevarda sugiere que

se podría promover la liberación de
dopamina al activarse CB1R
¿Cx35 puede estar siendo
fosforilada en las club
endings por la activación
de PKA?
 Western blots
Figura 8
(Polyclonal anti-Cx35/p110)

Digestión
alcalina de
fosfatasa

Anti-
Perdida de
Cx35/36
marcaje
Anti-
Cx35/P110

La PKA fosforila las conexinas (Cx35) marcadas en los Club Endings

 Modelo de potenciación mediada
CONCLUSIONES
por endocanabinoides
GRACIAAAS
Receptores de
Endocanabinoides

Receptores de Tipo I, acoplados a proteina G

Localizados en sistema nervioso central y
periferico
Gap Junctions -
Conexinas
 Técnica mediante la cual se detecta la presencia de un péptido o protéina
Inmunohistoquímica en una célula o tejido, utilizando un anticuerpo (monoclonal ó
policlonal, IgG ó IgM) específico contra él.
Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo producido por
una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B
descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática
tumoral.
Inmunoreactividad

Michael J. Bevan
Nature Reviews Immunology 4, 595-602 (2004)
Western blot
Método para identificar proteínas

1. las proteínas son separadas mediante

electroforesis en geles que tiene en cuenta
propiedades como peso molecular,
estructura, hidrofobicidad
2. posteriormente se transfieren a una
membrana, mediante la aplicación de un
campo eléctrico perpendicular al gel.

Una vez completada esta operación la

proteínas de interés son reveladas por el
agregado de un anticuerpo específico, se
detecta la unión antígeno-anticuerpo por
la actividad enzimática o fluorescencia
 Estílulo tetánico: estimolación del octavo nervio con
6 pulsos a 500Hz aplicado cada 2 segundos
Electrofisiología durante 4 minutos

Despolarizaciones dendriticas: 5 pulsos de 90nA

cada uno duró 5 s aplicados cada 4 s por el
electrodo de registro, se espera que esta corriente
lleve el potencial de membrana a 0mV
Canales
ionotrópicos de
Glutamato
Cascada de
señalización
cAMP
ANTECEDENTES