UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA GENOMICA

BIOLOGIA MOLECULAR
GRUPO 2-2
DRA. ELIAKYM ÁRAMBULA MERAZ.

ELABORADO POR:

CERVANTES OSUNA ANA ROCIO, CUEVAS GAMBOA DANIEL HUMBERTO,

MEDINA ORTIZ DANIEL ALONSO Y ROJO SOLORZANO MANUEL.
 ELECTROFORESIS
Migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo
de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento
generado por el campo eléctrico.

La mayoría de las
biomoléculas poseen carga
eléctrica.

Ácidos Proteínas:
Nucleicos: carga + o –
carga – Separación
por
tamaño.

En la electroforesis los Ac.

Nucleicos migraran siempre
hacia el polo positivo.
(ánodo +)

Electroforesis de frente
móvil
El campo eléctrico se aplica a
disoluciones o suspensiones.
En donde están presentes las
moléculas (Arne Tiselius
1937).
Determinación de
movilidades y puntos
isoeléctricos
Tipos de electroforesis
Electroforesis Zonal Electroforesis Continua
El campo eléctrico se aplica a
La muestra se aplica también
un medio o soporte
en una zona, pero se añade
estabilizante y la muestra se
continuamente a lo largo del
deposita en una zona
proceso.
reducida del mismo.
Analizar mezclas, determinar
Separación de proteínas,
pureza, cambios de movilidad
péptidos, Aa, iones
o conformación y
inorgánicos.
purificación.
• Cámara de electroforesis: dispositivo que permite la
generación de un campo eléctrico alrededor de un gel
donde se depositan las muestras. Este campo se
genera dentro de una solución amortiguadora en la
que se encuentra sumergido el gel que contiene las
muestras. La cámara cuenta con dos polos que se
conectan a una fuente de energía.
 Agarosa
• ADN y Proteínas
Gel: Acrilamida
• Solo Proteínas

Compuesto por polímeros que

forman una especie de malla o
microporos tridimensionales a través
de los cuales avanzan las moléculas,
según el peso molecular, lo que
permite la separación por tamaño de
los diferentes componentes de la
muestra.
 El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración
de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente
proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a mayor
concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta.
que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido
a temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente en
temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifica
cuando se enfría formando un gel altamente poroso.
A. No es un componente toxico.
B. Permite realizar análisis de Ac. Nucleicos con pesos
moleculares variados. (según las concentración que
se emplee).
C. Poder de resolución menor que la Poliacrilamida

El gel se coloca de
manera que los
Una vez obtenido
La agarosa es un pocillos queden
el líquido de
polvo que para en el extremo
agarosa, antes de
disolverse donde se localiza
que se enfrié a
requiere en polo negativo
menos de 50°C
calentarse hasta la de la cámara de
se coloca en una
ebullición del electroforesis,
cámara para
solvente. para permitir que
formar el gel.
la muestra corra a
lo largo del gel.
Los ácidos nucleicos lineales con un peso molecular alto migran
al ánodo más lentamente que los de menor peso molecular.

La migración no sólo depende del peso molecular sino también

del grado de empaquetamiento que presenten.

La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis

de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.
 - Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa
experimenta autopolimerización de forma espontánea y
La acrilamida es un polímero sintético,
lenta, con el resultado de que las moléculas de acrilamida se
termoestable, incoloro y químicamente inerte, con
unen cabeza con cola. La formación del gel requiere que
el que se pueden generar geles con un amplio
varias cadenas queden trabadas (lo que se consigue con la
intervalo de tamaños de poro.
bisacrilamida).
• NEUROTOXINA - La bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la acrilamida
• Soporta mayores voltajes y establece puentes entre las cadenas lineales de
poliacrilamida, con lo que se evita su deslizamiento y
• Teñir y desteñir conduce a la formación del gel.
• Siempre se realiza en cámaras verticales - También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado,
seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la
hidrólisis.
- El gel de poliacrilamida es el resultado de la
polimerización química de una mezcla de acrilamida y
bisacrilamida.
- El tamaño de poro de un gel de acrilamida está
determinado por la concentración total de acrilamida
presente (acrilamida + bisacrilamida), que
generalmente se maneja en .
 Migración:

• El TAE es mejor para el análisis electroforético de

• El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH
que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya
sea de agarosa o de acrilamida.
• Éste proporciona el medio para la transmisión de la
corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras
se realiza el corrimiento.
• En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o
TAE como buffer de corrimiento.
fragmentos grandes de ADN (900 – 2000bp) ya que
corren más rápido y tiene mayor capacidad de
discriminación en un gel de agarosa a 0.8%. Mientras
que en TBE para fragmentos pequeños de ADN (100 –
500bp) corren más rápido y tiene mayor capacidad de
discriminación en gel de agarosa al 2%.
Capacidad tamponante:
• El TBE es más estable y tiene una capacidad tampón
más alta que el TAE.

Reciclaje:
El buffer de
corrimiento de • El TAE no aguanta más de 3 corridas de electroforesis
El buffer TBE El buffer TAE seguidas sin alterar sus propiedades, mientras que el
electroforesis
contiene Tris contiene Tris TBE dura 3 o 4 días independientemente de las
de proteínas corridas de electroforesis realizadas.
base, ácido base, ácido
lleva Tris, 25
bórico y EDTA, acético y EDTA,
mM, SDS al 1%
y se maneja a ajustado a pH Recuperación del ADN:
y glicina, 192
un pH de 7.2. 8.5.
mM, a un pH • El TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa, lo
8.3. que provoca una recuperación baja del ADN.
Moléculas de ADN o proteínas que permiten determinar por
comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o
proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.

Para ADN Para Proteínas

Fagos o plásmidos sometidos a corte
con enzimas de restricción que Proteinas de peso
generan fragmentos de tamaño. (Fago conocido (10 hasta los
Phi X174/Hae III) 300 kDa) teñidas o
Escaleras (moléculas sintéticas de coloreadas
ADN) ej.1 Kbase plus ladder
 Este amortiguador tiene como fin
brindar peso, densidad y color a la
muestra, lo que facilita su depósito
en el pocillo y evita su salida del Buffer de carga
gel; permite, además, monitorear el
corrimiento de la muestra en el
gel.

Se emplea en relación1:3 para

ácidos nucleicos o 1:6 para
proteínas, respecto a la cantidad Proteínas Ac. Nucleicos
de muestra.

En el caso de que se deseen

condiciones desnaturalizantes y Tris-HCl, pH 6.8, Contiene Tris, azul
reductoras, deberá añadirse beta- ditiotritiol (DTT), de bromofenol,
mercaptoetanol a este buffer y SDS, glicerol y azul azul de xileno y
habrá que calentar las muestras a
95°C por 5 minutos de bromofenol glicerol
 TRASLUMINADOR VIOLETA

El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta

a través de la muestra, excitando la molécula cromogénica
que emite energía fluorescente que permite visualizarla.
En general emiten energía a una longitud de onda a 302
nm, aunque también existen para 254 y 365 nm; y suelen
contar con un botón para baja/alta intensidades por si se
requiere una menor exposición de la muestra a la luz
ultravioleta.
Algunos también permiten la selección de entre dos
longitudes de onda, lo que los hace más flexibles.
Los epitransiluminadores (365, 480 nm) generan la
emisión visible por fluorescencia igual que el
transiluminador pero, a diferencia de éste, la fuente de
energía se encuentra reflejada y no pasa a través de la
muestra.
El epi-iluminador es efectivo en geles muy densos.
 Electroforesis horizontal
• Se lleva a cabo en gel de agarosa para Ac. Nucleicos
• El buffer debe cubrir el gel para evitar que se seque
por el calentamiento inducido por el paso de la
corriente eléctrica
• Al momento de cargar las muestras en los pocillos,
se puede optar por hacerlo en seco
• Electroforesis submarina, la totalidad del gel se
cubre con buffer de corrimiento
En esta técnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y se
llama submarina cuando la muestra se coloca con el gel
sumergido en el buffer.
La muestra se coloca después de haber vertido el buffer de
corrimiento y retirado el peine que sirve de molde para la
formación de los pocillos.
Electroforesis Vertical
• Exclusivamente con gel de poliacrilamida
• Proteínas o Ac. Nucleicos con bajo tamaño
• El gel debe estar contenido entre dos placas
rectangulares de vidrio donde la corriente eléctrica
se genera gracias al buffer en el que se encuentra
embebido el gel y llena las cubetas o
compartimientos del ánodo y el cátodo.
En esta cámara se aprecia cómo el gel de acrilamida ha quedado
embebido en buffer de corrimiento en su extremo superior gracias a la
colocación de amortiguador en la parte interna de la cámara. El buffer de la
parte externa permite que el polo positivo cuente con la misma solución
buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
 Preparar un gel de Mezclar las muestras
Realizar la corrida Visualizar los
agarosa o acrilamida a a analizar con un Cargar las muestras
electroforética al ácidos
la concentración buffer de carga en el gel
voltaje pertinente nucleicos
requerida. adecuado.
 Electroforesis de ADN
• El método más común para la electroforesis de ADN es
elaborar un gel horizontal de agarosa, con una
concentración de 0.5 a 2%.
• La movilidad de la electroforesis dependerá únicamente
de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas.
• El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a
mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento.
• Si los fragmentos de ADN son pequeños (menos de 50
pb) o bien se requiere discernir entre fragmentos de
ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20
pb, se recomienda utilizar un gel de poliacrilamida que
permita esta resolución.
• Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la
preparación de geles a elevadas concentraciones y se
aconseja para obtener una buena separación de
moléculas de ADN con < 1000 pb.
• Son ideales para preparar geles analíticos de productos
procedentes de técnicas de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) u otras. Algunas son capaces de separar
fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb.

Estandarizar la concentración de
agarosa mas adecuada.
El volumen de agarosa depende
del tamaño de la cámara de
electroforesis; 20 a 25 ml son
suficientes para las dimensiones
más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5
cm (L × A × A)
Inmediatamente después de
vaciar la agarosa a la cámara,
debe insertarse el o los peines
necesarios.
Marcador de peso molecular en,
por lo menos, uno de los
carriles.
Las muestras se mezclan con el
buffer de carga y se depositan
cuidadosamente en los pocillos,
evitando que se salgan y puedan
entrar en otros pozos
contaminando el pocillo
contiguo.
Una vez solidificado el gel, se
añade el buffer de corrimiento
(TAE o TBE) a concentración 1×,
cubriendo perfectamente el gel
(0.5 a 1 cm por encima del gel) y
se retiran los peines.
Transmisión de la corriente
eléctrica. Para el caso de
productos de PCR (entre 100 pb
y 1.5 kb), voltajes entre 75 y 100
V. Para muestras de ADN
genómico y plasmídico (> 2 kb)
valores 25 y 75 V
Estandarizar el tiempo de
electroforesis a fin de conseguir
la mejor resolución posible.
La electroforesis se detiene
cuando se considera que la
muestra se localiza en la
posición deseada, o bien cuando
la muestra ha corrido por lo
menos tres cuartas partes del
gel.
Bromuro de etidio:

• Colorante fluorescente que tiene la propiedad de

intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el
ARN.
• AGENTE MUTAGENICO. TERATOGENICO Y
CANCERIGENO.
• Se incorpora a la agarosa (0.5 mg/ml) antes de permitir
la solidificación, o puede incorporarse luego del
corrimiento.
• Fluorece de color naranja cuando se expone a la luz
ultravioleta (absorción de 254 nm, con longitud de
emisión de 366 nm).

SYBR® Safe

• Se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos.

• Fluorescencia a 280, una excitación máxima a 502 nm y
una emisión máxima a 530 nm.
• Se une con gran afinidad al surco menor del ADN
bicatenario
• 25 veces más fluorescente que el bromuro de etidio.
La electroforesis en gel de campo pulsado
(PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
permite la separación de moléculas de ADN
de tamaño muy elevado. Las principales
diferencias con la electroforesis
convencional se encuentran en la
preparación de las muestras, el equipo de
electroforesis y la elección de los
parámetros (tiempo de pulsos, voltaje, etc.)
en función del rango de tamaños que se
pretende separar.
Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984
un sistema denominado electroforesis en
gel de campo pulsante (PFGE) con el que
consiguieron separar cromosomas de
levadura de varios cientos de kpb
Parámetros que afectan:
Tiempo de pulsos

Intensidad de campo (voltaje)

Tiempo total de electroforesis

Concentración de agarosa

Ángulo de separación de los campos

eléctricos alternantes.

Temperatura.

La acrilamida se prepara a partir
de una solución al 30% de
acrilamida-bisacrilamida 19:1
El gel de acrilamida se forma
entre dos vidrios, y el sistema
completo se sumerge en el
buffer de corrimiento dentro de
la cámara vertical de
electroforesis
Marcador estándar de proteínas
para la medición del peso
molecular de la muestra
Ésta se mezcla con el buffer
correspondiente y una solución
de SDS
Asegurar que los pocillos del gel
estén totalmente cubiertos por
el buffer.
Se conectan los cables
correspondientes de los
electrodos a la fuente de energía,
con la selección de voltaje o
amperaje adecuados
Se añade persulfato de amonio
APS), tetrametiletilenodiamina
(TEMED) como polimerizadores
en concentraciones del orden de
1 a 10 mM
La muestra mezclada con el
buffer de carga se deposita con
cuidado en los pocillos, evitando
la contaminación del pocillo
contiguo
La electroforesis se realiza hasta
que el colorante, visualizado
como una línea azul, haya llegado
a los límites de la parte inferior
del gel
 Azul brillante de Coomasie:
• puede detectar bandas de proteína de 50 ng
• El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática Tinción de plata.
del enlace peptídico de las proteínas sobre grupos de ácido
• Mas sensible
sulfónico, que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las
fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas Algunas veces, el gel se seca para conservarlo.
participan en este proceso de unión mecánica
 Analizar los fragmentos
Determinar los tamaños
cortados con enzimas de Comparar los tamaños de
moleculares de los ácidos
restricción (mapa de distintos tipos de ADN
nucleicos
restricción),

Aislar y recuperar Proceso previo a las

fragmentos de ADN Analizar productos de técnicas de hibridación
purificados para PCR (Southern blot o
clonaciones Northern blot)

Identificación de moléculas
particulares empleando
Identificación de fracciones
posteriormente una Es crucial en técnicas
proteicas o proteínas
reacción antígeno- como la secuenciación.
particulares por tamaño.
anticuerpo específica en la
técnica de Western blot.
 ACTIVIDAD
Basándose en la imagen de una electroforesis de agarosa para
fragmentos de ADN representada en la imagen, indique:
1. De qué peso molecular es la banda de menor tamaño del
carril C.
2. 2. De qué peso molecular es la banda de mayor tamaño del
carril D.
3. En qué carril y qué peso molecular presenta la banda que
tiene mayor concentración.
4. En qué carril y qué peso tiene la banda de menor
concentración.
5. En qué carril se localiza el marcador de peso molecular.
6. El sentido de corrimiento de las muestras