UNIVERSIDAD PRIVADA “FRANZ TAMAYO”

FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA: BIOQUIMICA Y FARMACIA

INTEGRANTES:
 FABIAN LIMACHI MIGUEL ANGEL
 COPAÑA MACHACA WILLIAM OSCAR

 ELISA
ES UNA TÉCNICA DE INMUNOENSAYO EN LA CUAL
UN ANTIGENO INMOVILIZADO SE DETECTA
MEDIANTE UN ANTICUERPO ENLAZADO A
UNA ENZIMA CAPAZ DE GENERAR UN PRODUCTO
DETECTABLE
 USOS
 FALSO POSITIVO
 FALSO NEGATIVO
 DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA
 TUBOS DE CRISTAL
 MICRO PLACAS DE 96 POCILLOS DE PLÁSTICO
 FASES DE UN ENSAYO ELISA
 CONJUGACIÓN DEL ANTICUERPO O DEL ANTÍGENO CON UNA
ENZIMA
 UNIÓN DEL ANTÍGENO (O DEL ANTICUERPO) A LOS POCILLOS
 FORMACIÓN DE UNA O MÁS CAPAS DE INMUNOCOMPLEJOS
 REVELADO DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA
TIPOS DE ENSAYOS ELISA
 ELISA DIRECTO
 ELISA INDIRECTO
 ELISA SANDWICH
 ELISA COMPETITIVO
 CONSIDERACIONES GENERALES AL
DESARROLLO DE LA TECNICA
 TODA MUESTRA DE SANGRE DEBE SER CONSIDERADA COMO MATERIAL
POTENCIALMENTE INFECCIOSA
 LAS MUESTRAS A PROCESAR NO DEBEN PRESENTAR HEMOLISIS NI
TUBIDEZ
 UTILIZAR KIST CON FECHA DE VENCIMIENTO
 DEJAR QUE TODOS LOS REACTIVOS ALCANCEN LA TEMPERATURA
AMBIENTAL
 MEZCLAR SUAVEMENTE LOS REACTIVOS LIQUIDOS
 MATERIALES Y EQUIPOS PARA LA
TECNICA DE ELISA

KIT DE ELISA PARA VIH

 LECTOR DE MICRO PLACAS

LAVADOR DE MICRO PLACAS

 ELISA - VIH
 VIH
- El VIH o Virus de la Inmunodeficiencia
Humana es un retrovirus que ataca al
sistema inmunitario de la persona
infectada.
- En concreto, el VIH ataca los linfocitos CD4.
Partes del virus VIH
 Pruebas de detección de VIH
 Las pruebas de detección se basan
en el test denominado ELISA.
 Así, mientras que los ensayos de
primera, segunda y tercera
generación permitían detectar
determinados anticuerpos HIV-1
(gp41) y HIV-2 (gp36)
 El ensayo de HIV Ag/Ac ELISA 4ª
Generación está diseñado para
detectar antígeno p24
La evidencia serológica de la
infección por HIV-1 y HIV-2 puede
ser obtenida determinando la
presencia de antígenos y
anticuerpos en el suero de
individuos en los que se sospecha
que tienen la infección.
 los de cuarta generación
detectan múltiples
anticuerpos e incluso
proteínas del propio virus
tales como el antígeno
p24 –que tiene una
concentración elevada
en sangre durante la fase
primaria de la infección.
 WESTERN BLOT
El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica
analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas
específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se
presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas
para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte
sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas
con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.1

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología,

como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la
inmunología
 METODOLOGIA
 El procedimiento comienza con una corrida electroforética en gel
de poliacrilamida para separar las proteínas de la muestra según
el criterio del método utilizado (SDSPAGE con β-mercaptoetanol
o sin el, electroenfoque, electroforesis nativa, entre otros).
Luego, las proteínas ya separadas son transferidas a una
memabrana de nitrocelulosaque las une con firmeza y en forma
no especifica por difusión, aunque la mas utilizada en la
actualidad es la electrotransferencia. Si se usa la difusión, una vez
que las proteínas fueron separadas el gel se recubre con una hoja
de nitrocelulosa que a su vez se cubre con una capa gruesa de
toallas de papel y el ensamble entero se comprime con una placa
pesada.
 METODOLOGIA
En consecuencia el liquido en el gel se transfiere a través de la nitrocelulosa. La
otra posibilidad es emplear la electro transferencia que se basa en aplicar una
corriente eléctrica y la utilización de un tampón de transferencia para llevar las
proteínas desde el gel a la membrana. Para ello se apilan en forma de sándwich
los siguientes elementos: esponja, papeles empapados con buffer de
transferencia, gel, membrana, papeles empapados con buffer y esponja, y luego
se le aplica una corriente eléctrica a todo el montaje para que las proteínas corran
al polo positivo y se atrapen en la membrana. Esta técnica es más rápida e
involucra a una mayor cantidad de proteínas que los otros métodos.
ELECTROFORESIS
- Para entender la técnica del Western Blot es necesario
comprender que es una electroforesis y en que se basa.
- Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se
aplica un campo eléctrico a una solución que contenga una
mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que
dependerá de su carga neta, forma y peso molecular. Esta
técnica es conocida como electroforesis.
- Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre
en soportes sólidos, generalmente para separar una mezcla
de proteínas, el soporte de elección son los geles de
poliacrilamida.
WESTERN BLOT
La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o
Western blot) es un sistema rápido y muy sensible para la
detección y caracterización de proteínas que se basa en la
especificidad de reconocimiento entre antígeno y
anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en
geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e
irreversible a una membrana, de las proteínas de una
mezcla compleja (lisado total celular). Los antígenos que
se han transferido a la membrana son reconocidos por
anticuerpos monoclonales policlonales específicos de
ellos.
TIPOS
 Se puede hablar de tipos de western blot
según el tipo de detección de las proteínas.
Directo:
 El anticuerpo primario marcado se une al
antígeno de la membrana y reacciona con el
su strato originando una señal detectable. En
el método directo de detección, el anticuerpo
primario que se utiliza para detectar el
antígeno sobre la superficie de la membrana,
debe ir marcado con una enzima
METODO DIRECTO
Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el
antígeno. Luego, un anticuerpo secundario
marcado se une al primario y reacciona con el
sustrato. En el método indirecto, se añade primero
un anticuerpo primario sin marcar contra el
antígeno de la superficie de la membrana;
posteriormente se añade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo primario.
METODO INDIRECTO
El procedimiento de 'blotting' consta de 5
etapas:
1- Inmovilización de proteínas
sobre la membrana,
generalmente mediante
electrotransferencia.
 2- Saturación de todos los lugares de unión de
proteínas de la membrana no ocupados para evitar la
unión no específica de anticuerpos.
 “Bloqueo de la membrana”, para prevenir la unión inespecífica de
los anticuerpos a otras proteinasla membrana, con el riesgo
asociado de tener un elevado “background” o falsos positivos.
3- Incubación del 'blot' con anticuerpos primarios
contra la/s proteína/s de interés.
Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blot
dependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos
disponibles para ese antígeno en concreto.
4- Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o
reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario
unido a enzimas u otros marcadores.
 Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que
reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario).

5-Sistema de revelado de las bandas de proteínas

marcadas con el complejo de anticuerpos.
Lavado de la membrana.

 Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie

de pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones de
bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos
lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no
unidos
APLICACIONES
 Se usa principalmente para determinar la
presencia o ausencia de una proteína concreta en
una muestra. También nos puede ser útil para
determinar los niveles de dicha proteína en esa
muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en
determinadas enfermedades el problema no es la
ausencia total de una molécula sino su reducción o
la expresión de una forma truncada de dicha
proteína.
APLICACIONES
- Enfermedades Inflamatorias
- Enfermedades Infecto-Contagiosas
- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
- Factores de Crecimiento
- Proteínas de Secreción
- Enfermedades Infecto-Contagiosas
- Enfermedades Inflamatorias
- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
- Factores de Crecimiento
- Proteínas de Secreción
 APLICACIONES
 Prueba de VIH
 Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot
se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado
positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la
prevalencia del virus es muy baja.
 Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una
muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas
de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba
el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente
a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en
el suero, serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se
lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a
incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-
señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las
cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es
seropositivo.
APLICACIONES
 Se emplea como prueba definitiva de la
encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las
vacas locas".
 Algunas clases de la prueba para la
enfermedad de Lyme usan el Western blot.
 En veterinaria, ocasionalmente se emplea el
Western blot para confirmar la presencia del
FIV en gatos.
GRACIAS