Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología.

Facultad de Farmacia
Tema 13
Investigación y recuento de Clostridium perfringens
Clostridium perfringens, es un bacilo Gram+, bastante grande, de 4-8 x 0,3-1,5 μm. Forma
esporas ovales subterminales no deformantes. Tienen capsula, son inmóviles y anaerobios estrictos.
Reducen nitratos a nitritos. Producen SH2. Fermentan muy rápidamente la lactosa (con
producción de ácido y gas), y glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, manitol, inositol y sacarosa.
Producen lecitinasa.

Se encuentran en suelo y aguas y formando parte de la flora microbiana normal del tubo digestivo de
animales y hombre.
Es un microorganismo patógeno para animales y el hombre. Produce varios tipos de toxinas según
las cuales se clasifican en varios tipos: A,B,C,D y E.
El tipo A produce una enterotoxina causante de intoxicación alimentaria, el tipo B es el causante de la
gangrena gaseosa, el tipo C es el causante de la enteritis necrotizante y los tipos D y E no son
patógenos.
La enterotoxina es ternolabil y se produce durante la fase de transición de las células vegetativas a
esporas y se libera cuando las esporas están formadas. Las condiciones alcalinas del intestino delgado
favorecen la esporulación. La toxina se fija a unos receptores de las células con borde en capillo del
intestino delgado alterando la permeabilidad de la membrana, ocasionando pérdida de líquidos.

Síntomas: tras un periodo de incubación corto, (8-24h) aparece una diarrea acuosa con espasmos
abdominales sin fiebre nauseas ni vómitos. No es grave u dura unas 24h.
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia
Tema 13
Investigación y recuento de Clostridium perfringens

Técnica en tubos
Técnica en tubos
Agar triptona sulfito neomicina
(Tryptone Sulphite Neomicin: TSN)
Suspension madre 1:10 TW
Peptona de caseína 15 g
Extracto de levadura 10 g
10 ml Sulfito sódico 1g
Citrato de hierro 0,50 g
Sulfato de polimixina B 0,02 g
Sulfato de neomicina 0,005 g
Agar 14 g
Agua destilada 1.000 ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml
Pruebas confirmativas

Lactosa + Movilidad -
Gas +

Medio TSN

Cultivo en anaerobiosis 46ºC 24-48 h

Colonias negras rodeadas de un halo
blanco por la acción de la lecitinasa
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Tema 13
Investigación y recuento de Clostridium perfringens

Técnica en placas

Suspension madre 1:10 TW

Agar triptona sulfito neomicina
(Tryptone Sulphite Neomicin: TSN)
10 ml
Peptona de caseína 15 g
Extracto de levadura 10 g
Sulfito sódico 1g
Citrato de hierro 0,50 g
10-1 10-2 10-4 10-5 Sulfato de polimixina B 0,02 g
10-3
Sulfato de neomicina 0,005 g
Agar 14 g
Agua destilada 1.000 ml

1 ml

Medio TSN
Cultivo en anaerobiosis46ºC 24-48 h
Pruebas confirmativas

Lactosa + Movilidad -
Gas +

Colonias negras rodeadas de un halo blanco por la

acción de la lecitinasa
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Tema 13
Medio para Clostridium reforzado
Investigación y recuento de Clostridium perfringens (Reinforced Ciostridial Medium:RCM)
Extracto de levadura 3g
Extracto de carne 10 g
Técnica en medio líquido. NMP Peptona 10g
Dextrosa 5g
Suspension madre TW Almidón soluble 1g
Cloruro sódico 5g
Acetato sódico 3g
1 ml 1 ml 1 ml
Clorhidrato de cisteína 0,50 g
Agar 15 g
Agua destilada 1.000 ml
Añadir 100μl de Neomicina por ml de medio
Agar-lactosa-leche-yema de huevo (LYL)
Ext. Carne 10g
10-1 10-2 10-3 Lactosa 12 g
Rojo neutro (10 g/1) 0,03g
Colonias negras rodeadas de Tioglicolato sódico 0,12g
Caldo Clostridio Reforzado RCM un halo blanco por la acción Agar 15 g
de la lecitinasa Agua destilada 1.000 ml
Añadir 15 ml de emulsión de yema de huevo
Pruebas confirmativas y 25 ml de leche desnatada a 825 ml de medio
base.
Lactosa + Movilidad - Triptosa-Sulfíto-Cicloserina con Yema de
Incubación 46ºC, 24 h. Gas + huevo (TSCY)
Triptosa 15 g
Lectura en tablas NMP Soja 5g
Extracto de levadura 5g
Metabisulfito sódico 1g
Agar TSCY
Citrato férrico amónico 1g
Agar 20 g
Incubación 46ºC, 24 h.
Agua destilada 1.000 ml
Añadir 4 ml de Cicloserina al 1% y 6 ml de
Agar LYL emulsiçon de yrma de huevopor cada 90 ml de
medio
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Tema 14

Investigación de estreptococos fecales

Son microorganismos de forma cocoide que se agrupa en parejas o en cadenas. Son,
generalmente, inmóviles, no esporulados, Gram + y catalasa-negativos, microaerófilos o
anaerobios facultativos.

De acuerdo con el esquema de Lancefield, se agrupan antigénicamente mediante las letras A,

B, C, D, etc. Al grupo D de Lancefield pertenecen los estreptococos fecales, por ser su hábitat
normal el tubo digestivo de animales de sangre caliente. Entre sus características peculiares,
está el poder crecer a temperatura de 45ºC y en medios con 4% de bilis.

Los estreptococos fecales, agrupan a Streptococcus faecalis y sus variedades Str. faecium y Str.
duran que viven generalmente en el intestino humano. Otros estreptococos fecales viven en los
animales como Str. equis y Str. bovis. Recientemente este grupo de microorganismos que se
denominaban enterococos se han separado en un genero nuevo denominado Enterococcus.

En si no se les considera patógenos pero si se les ha relacionado con algunos procesos

diarreicos y de vómitos que aparecen entre 2-30 horas de consumido el alimento y duran unas
pocas horas.

Los estreptococos son importantes por ser considerados indicadores de contaminación fecal, y
su presencia en los alimentos indica falta de higiene o condiciones de conservación
defectuosas, excepto en alimentos en los que interviene como flora habitual de procesos
fermentativos.
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Tema 14
Investigación de estreptococos fecales
Método de Presencia - Ausencia

Suspension madre 1:10 TW Colonias pequeñas con un halo KAA Kanamicina-Aesculina-Azida

negro alrededor por hidrólisis de la Triptona 20 g
esculina Extracto de levadura 5g
Cloruro sódico 5g
Citrato sódico 1g
Esculina 1g
Citrato férrico amónico 0,50 g
Azida sódica 0,15 g
1 ml Sulfato de kanamicina 0,02 g
Agua destilada 1.000 m

9 ml caldo KAA

Incubación 37ºC, 24h

Tubos + : negros por
hidrólisis de la esculina
0,1 ml
Pruebas identificación
Tinción Crecimiento Esculina Crecimiento
Agar KAA Gram 45ºC bilis 6,5% ClNa
Incubación 37ºC, 24h

Colonias típicas

PCA
Incubación 37ºC, 24h
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia
Tema 14
Investigación de estreptococos fecales
Método en Medio Líquido NMP
Colonias pequeñas con un halo KAA Kanamicina-Aesculina-Azida
Suspension madre 1:10 TW negro alrededor por hidrólisis de la Triptona 20 g
1 ml 1 ml 1 ml esculina Extracto de levadura 5g
Cloruro sódico 5g
Citrato sódico 1g
Esculina 1g
Citrato férrico amónico 0,50 g
Azida sódica 0,15 g
Sulfato de kanamicina 0,02 g
10-1 10-2 10-3 Agua destilada 1.000 m

9 ml caldo KAA
Incubación 37ºC, 24h
0,1 ml Pruebas identificación
Tinción Crecimiento Esculina Crecimiento
Agar KAA Gram 45ºC bilis 6,5% ClNa

Incubación 37ºC, 24h

Colonias típicas

PCA
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Caldo de Litsky
Investigación de estreptococos fecales Caldo de Rhote simple
Peptona 20 g Peptona 20 g
Glucosa 5g Glucosa 5g
Método empleado en el análisis de aguas Cloruro sódico 5g
Cloruro sódico 5g
Estreptometria Hidrógeno fosfato dipotásic 2,70g
Hidrógeno fosfato dipotásico 2,70 g
Dihidrógeno fosfato potásico 2,70 Dihidrógeno fosfato potásico 2,70g
Suspension madre 1:10 TW Azida sódica 0,30 g
gAzida sádica 0,20 g
Agua destilada 1.000 ml Violeta de etilo 0,0005 g
Agua destilada 1.000 ml

Medio de Barnes al trifenil tetrazolio

9 ml caldo Rhote Peptona 10 g
Extracto de carne 10 g
Glucosa 10 g
Agar 15 g
Tubos +: turbidez
Agua destilada 1.000 ml
Incubar 37ºC, 24h Añadir 5 ml de Cloruro de Trifenil
Tetrazolio al 0,2% y 5 ml de Acetato de
Talio al 2% Colonias pequeñas y de color rojo por
la reducción del TTC a Formazano,
de color rojo
9 ml Caldo Litsky

Pruebas identificación
Incubar 37ºC, 24h
Tinción Crecimiento Esculina Crecimiento
Tubos +: turbidez, a veces se forma un
Gram 45ºC bilis 6,5% ClNa
depósito violeta en el fondo

Agar KF Barnes
Incubar 37ºC, 24h
Colonias típicas