Disciplina: BQA5132 – Bioquímica II

Professora: Fátima Regina Mena Barreto Silva

Acadêmicas: Brenda de Espíndola (11100360)
Flávia Cardoso Amaral (11100376)
Curso: Farmácia
 Avaliar as respostas inflamatória, oxidativa e
redutora na progressão do diabetes melito tipo 1.

 Pacientes com DMI durante os primeiros anos após

o diagnóstico (0-10 anos) e durante a progressão
da doença (10-20 e >20 anos) após o diagnóstico,
mas sem complicações crônicas e em indivíduos
saudáveis.
 A hiperglicemia está associada com a ativação de
processos metabólicos, como por exemplo, a
ativação de PKC e o aumento de AGEs, que
implicam em processos oxidativos que envolve a
geração de espécies reativas de oxigênio, sem
haver um aumento de antioxidantes.
 O aumento de AGEs ROS leva a um estresse
oxidativo, que em células endoteliais pode resultar
em uma disfunção endotelial e dano vascular.

 Pressuposto para as complicações da diabetes

como a aterosclerose.
 Patologias em diabéticos mellitus tipo I geralmente
não são detectadas nos primeiros 5 anos após o
início da doença, mesmo assim um significante
aumento na formação de ROS já pode ser
detectado.

 ROS estimulam Proteina Quinase C pela via do

diacilglicerol (DAG), dando origem a uma grande
produção de citocinas inflamatórias,
principalmente a interleucina 6, que é considerada
a primeira mediadora de respostas inflamatórias
agudas.
 Existem poucos estudos sobre as mudanças que
ocorrem na resposta inflamatória, oxidativa e
redutora durante a progressão da diabetes mellitus
tipo 1.
 42 pacientes com DMI e 24 pessoas saudáveis.
 Excluídos do estudo:
o Pacientes diabéticos que exibiram complicações micro
ou macrovascular ou cetoacidose no ano anterior;
o Aqueles que estavam tomando estatina e/ou
metaformina e/ou vitaminas;
o Os que estiveram sujeitos a infecções, demência,
inflamação, ou doença maligna;
o Os viciados em tabaco ou álcool;
o As que estiveram grávidas.
 Pacientes com DMT1 que foram selecionados:
o Os que apresentaram o início da doença 13 +/- 9 anos
antes;
o Os que apresentaram história de cetoacidose diabética;
o Os que são positivos no teste de anticorpos para ácido
glutamato desidrogenase e peptídeo C (<0,5 ng/mL).
 Todos os pacientes com DMI estavam recebendo
terapia de insulina intensiva por meio de múltiplas
injeções diárias.
 Os pacientes foram dividido em 3 grupos, de
acordo com o tempo decorrido desde o
diagnóstico:

0-10 anos 10-20 anos > 20 anos

 Amostras de sangue eram coletadas entre 7 e 8
horas da manhã usando a punção venosa padrão.

 Plasma foi obtido por centifrugação do sangue

venoso heparinizado, sendo armazenado a -20ºC
até o momento da análise.

 Granulócitos foram purificados usando um

gradiente Ficoll-Hypaque (consiste de uma mistura de
polissacarídeos neutros hidrofílicos de alta densidade que se
dissolve prontamente em solução aquosa) de acordo com o
método descrito por Bicalho e cols.
PLASMA

CÉLULAS BRANCAS

FICOLL-HYPAQUE

CÉLULAS VERMELHAS
 Determinação Luminométrica da geração ROS em
granulócitos foi realizado usando um ensaio de
quimioluminescência quantitativa.
Granulócitos suspensos em Transferidos para um tubo
solução salina tamponada de luminescência não Quimioluminescência foi
de fosfato selado dissolvidos em 0,4 observada por 30min.
M de dimetil sulfóxido.

Produção de ROS é
Resultados foram Monitoramento estimulada por adição de
expressos em Unidade quimioluminescência por uma alíquota de 10 µL de
Relativa de Luz (RLU) por mais 30min. 10^-4 M de Éster forbol
minuto 12,13-dibutirato (PDB),
 Determinado a partir da redução direta do brometo
de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniletrazolium
(MTT) de acordo com o método de Medina e cols.
Uma alíquota de 200 µL
de plasma é misturado O volume final é ajustado A mistura é incubada
com 25 µL de solução com 500 µL de PBS por 120 min a 37ºC
MTT (50mg/mL de PBS)

Absorbância do
A mistura é Adição de 1 mL de 0,04
sobrenadante é medida
centrifugado (200g, M de ácido hidroclórico
em comprimento de
10min) em isopropanol.
onda de 570 nm.
 Concentração de IL-6 no plasma determinado com
teste Elisa usando quite de ensaio Human IL-6
Enzyme Immunometric.
 Características clínicas de pacientes com Diabetes
Melitts I e indivíduos saudáveis foram muito parecidas.

 Em relação a características bioquímicas, valores de

glicemia do jejum foram significativamente maiores em
pacientes diabéticos, enquanto nível de hemoglobina
glicada em pacientes com diabetes tipo I (8,84%) são
um pouco maior do que o intervalo aceita para
indivíduos saudáveis (<7%).

 Diferenças significantes entre grupos com DMI foram

observadas em alguns parâmetros, embora estes não
foram significativos na prática clínica. (Lipoproteínas)
 A diferença significante foi detectada entre pacientes com DMI e
indivíduos saudáveis em relação com o valor de ROS produzidos
em granulócitos não estimulados (4,836 versus 2,036 RLU/min,
respectivamente).
 A presença do Éster de forbol em granulócitos estimulou
produção de ROS diferente em pacientes diabéticos e em
indivíduos saudáveis (222369 e 5780 RLU/min,
respectivamente).
 Nível de IL-6 no plasma de pacientes com diabetes foram
significativamente mais alto em relação a de indivíduos
saudáveis (14,2 versus 9,7 pg/mL, respectivamente).
 Não foi observado diferença significante entre pacientes diabéticos e
indivíduos saudáveis em relação a redução de resposta do plasma (0,3
versus 0,29 OD570).
 Em relação aos níveis de biomarcadores inflamatórios e redução de
respostas do plasma determinados em relação aos grupos de DMI, não
houve diferença significativa entre os grupos.
 Estado antioxidante do plasma não teve diferença significativa entre
indivíduos saudáveis e grupos individuais de pacientes com DM I. Porém
no nível de biomarcadores inflamatórios, esses marcadores foram
significativamente maiores em pacientes com DMI do que em indivíduos
saudáveis
 Não há correlações significativas entre os grupos
de pacientes com DMI em relação aos níveis de
biomarcadores inflamatórios.

 Resultado similar foi observado em relação ao

estado antioxidante do plasma.

 Adicionalmente, não há correlação entre nível de

glicose em jejum, hemoglobina glicada e
biomarcadores inflamatórios ou estado
antioxidante do plasma.
 Resultados obtidos no presente estudo sugere a presença de
inflamações sistêmicas em pacientes diabéticos em todos os
momentos após o diagnóstico diabético.

 Aumento da resposta de oxidação metabólica na ausência de

aumento compensatório na capacidade antioxidante do plasma, e é
indicativo de estresse oxidativo no início da doença e ao longo da
diabetes.

 A geração de ROS, e o estresse oxidativo resultante, desempenha

um papel central na complicação da patogenia diabética.

 ROS desencadeia uma cascata inflamatória por meio da produção

de citocinas pró-inflamatórias, principalmente a IL-6, que está
envolvida na patogênese de complicações micro e
macrovascular.
 Aumento nos níveis de diacilglicerol (DAG) e na atividade de PKC
induzidos por hiperglicemia, que também tem sido associados
com a iniciação de complicações diabéticas.

 Éster de forbol é análogos de DAG, agindo do mesmo jeito in

vitro, o efeito hiperglicêmico do glicerídeo tem por estimulação
da PKC.

 No presente estudo, geração de ROS na presença de éster de

forbol foi aumentado (pacientes com diabetes e em
indivíduos saudáveis, mas o aumento foi muito mais intensa
em pacientes diabéticos).

 Isto sugere que a hiperglicemia ativa a expressão de PKC na

membrana.
 Observou um significativo aumento nos níveis de IL-6 entre os
pacientes diabéticos e indivíduos saudáveis, como relatado em
outros estudos.

 Não houve diferenças significativas nos níveis dos biomarcadores

inflamatórios entre o grupo de pacientes diabéticos de acordo com o
tempo de progressão da doença, mas em relação aos indivíduos
saudáveis observa-se um aumento considerável.

 Não foi observado diferenças significantes no estado de

antioxidantes no plasma entre indivíduos saudáveis e pacientes com
DMI.
 O resultado obtido no presente estudo sugere que, durante o
primeiro ano depois do diagnóstico da doença, quando a maioria
dos pacientes não apresentam complicações crônicas, DMI é
caracterizado de um perfil pró-inflamatório e ausência de
resposta antioxidante compensatória.

 Entretanto, esse tipo de perfil não difere daquele exibidos por

paciente DMI diagnosticados a mais tempo com complicações
micro e macrovascular são mais prevalentes.

 Em outras palavras, existe típicos estresse oxidativo desde

estágios iniciais da doença, e mudanças estruturais e funcionais
das complicações diabéticas pode começar nos primeiros anos
após o diagnóstico.