FERMENTACIONES

Sistemas de fermentación,
factores físicos y químicos
que afectan a la
fermentación.
Escalamiento. Detección,
recuperación y purificación
de los productos.
 Influencia de los efectores
internos y externos sobre la
expresión celular
 Esquema general de un
proceso de fermentación
Un proceso típico de fermentación comienza
con la formulación y esterilización del medio
de cultivo así como la esterilización del
equipamiento.

Las células se crecen primero en un cultivo

de mantenimiento (5 a 10 mL),
posteriormente en un matraz (200 a 1.000
mL) y de ahí en un prefermentador (10 a 100
L) para finalmente inocular el fermentador
de producción (1.000 a 100.000 L).
 Una vez que la fermentación se ha
completado, las células se separan del
cultivo líquido.

Si el producto es intracelular, se rompen las

células, se eliminan los restos celulares y
se recupera el producto del fluido libre de
restos celulares.

Si el producto es extracelular, se purifica a

partir del sobrenadante libre de células.
ETAPAS DEL PROCESO OPERACIONES
Seleccion
PRODUCTIVO Materia Prima Fragmentacion, Tamizado
Hidrolisis
formulacion de medio
Esterilizacion
Pre tratamiento
Produccion de Biomasa
Biosintesis de Metabolitos
Enzimas Inmovilizadas y
Biorreaccion
Catalis Celular
Biotransformaciones

Procesos de Filtracion & Centrifugacion

recuperación Sedimentacion & Flocculation
Disrupcion Celular
Extraccion
Ultrafiltracion
Precipitacion
Producto Cristalization
Cromatografia; Evaporacion
Secado y Empacado
DESARROLLO DE INÓCULO Biomasa

SEPARACION
Cultivo
DE
(fluido)
CELULAS
Cultivo Biorreactor
stock de siembra Biorreactor
de Sobrenadante
producción
EXTRACCIÓN
ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO DEL PRODUCTO

PURIFICACIÓN TRATAMIENTO
FORMULACIÓN DEL MEDIO DE EFLUENTES

EMPAQUE

Constituyentes del medio

EL FERMENTADOR./ DEFINICION OPERATIVA: 

“Recipiente en el que se mantiene un medio ambiente

favorable para la operación de un proceso biológico
deseado”.

En cuanto al biorreactor: “ Para cada proceso

biotecnológico, el sistema de contención más apropiado
debe diseñarse para brindar el mejor medio ambiente,
optimizado para el crecimiento celular y actividad
metabólica “.
• Biorreactor de Laboratorio
• Tratamiento de “BORRA” ( Residuo de Petróleo)
• Fig. PREFERMENTADOR de LABORATORIO. 10 Lts
 II. CRITERIOS PARA EL DISEÑO Y FUNCIONAMIENTO
DEL FERMENTADOR

1.- El tanque debe diseñarse para que funcione

asépticamente durante numerosos días, así
como para las operaciones de más larga
duración.

2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de

aireación y agitación para cubrir las necesidades
metabólicas de los microorganismos.

3.- El consumo de energía debe ser tan bajo

como sea posible.

4.- Debe tener un sistema para el control del pH.

5.- El fermentador debe tener un sistema para la
toma de muestras.

6.- Debe existir un sistema para el control de la

temperatura.

7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser

excesivas.

8.- El diseño del tanque debe ser tal que las

operaciones laborales durante el funcionamiento,
recolección, limpieza y mantenimiento sean
mínimas.
9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación
de diversas modalidades de procesos.

10.- Las superficies internas del tanque deben

ser lisas, utilizando, donde sea posible,
soldaduras.

11.- La geometría del fermentador debe ser

similar a otros tanques más pequeños o mayores
de la planta o a los de la planta piloto para poder
reproducir procesos a diferentes escalas.

12.- deben emplearse los materiales más baratos

que proporcionen resultados satisfactorios.

13.- Debe existir un servicio adecuado de

repuestos para el fermentador.
FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL
RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES
INDUSTRIALES

1.- Oxígeno
2.- Temperatura
3.- pH
1.- Oxígeno.- Uno de los factores más críticos en
la operación de fermentación a gran escala es el
suministro de un intercambio de gases adecuado.
El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante
para el metabolismo microbiano y el anhídrido
carbónico es el producto metabólico más
importante.

El Oxígeno no es un gas muy soluble ya que una

solución saturada de oxígeno contiene aprox. 9
mg / L de este gas en agua. debido a la influencia
de los ingredientes del cultivo, el contenido
máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo
que debería ser en agua pura.

El suministro se logra pulverizando aire en el

fermentador durante el proceso.
La ley de Henry describe la solubilidad del oxígeno
en soluciones de nutrientes en relación a la presión
parcial del oxígeno en la fase gaseosa:
P0
C= ------ ;
H

En esta ecuación C es la concentración de O2 de la

solución de nutrientes a saturación, P0 es la presión
parcial del gas en la fase gaseosa y H es la
constante de Henry que es específica para cada tipo
de gas.

A medida que aumenta la concentración de O2 en la

fase gaseosa, aumenta la proporción de O2 en la
• La presión más alta de O2 se consigue durante la
aireación con oxígeno puro. Comparado con el valor
obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se
disuelven 43 mg O2/L cuando se utiliza oxígeno
puro.

• Otra característica es que a medida que aumenta la

temperatura desciende la solubilidad del oxígeno.
Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse
desde la burbuja de gas a cada célula individual.
Para ello deben ser superadas varias
resistencias parcialmente independientes:

a.- La resistencia dentro de la película de gas a

la interfase.

b.- La penetración de la interfase entre la

burbuja de gas y el líquido.

c.- Transferencia desde la interfase al líquido.

d.- Movimientos dentro de la solución de

nutrientes.
En las fermentaciones que se llevan a cabo con
organismos unicelulares como bacterias o
levaduras, el factor más importante que controla la
velocidad de transferencia es la resistencia en la
interfase entre la burbuja de gas y el líquido.

Las células microbianas próximas a la burbuja de

gas pueden absorber directamente el O2 a través de
la interfase aumentando la transferencia del gas a
estas células.

En los aglomerados de células o en las bolitas de

micelio, la transferencia de gas dentro del
aglomerado puede ser un factor limitante.
• Por último indicar la concentración crítica de oxígeno
que es el término utilizado para expresar el valor de la
velocidad específica de absorción de oxígeno que
permite la respiración sin impedimentos.

• Esta concentración crítica de oxígeno suele tener

unos valores concretos para cada microorganismo
oscilando de forma general entre el 5% y el 25% de los
valores de saturación de oxígeno en los cultivos.
2.- Temperatura.- Los microorganismos que crecen a
una temperatura inferior a la óptima tienen retardado
su crecimiento y por lo tanto reducida la producción
celular, es decir su productividad.

Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se

puede inducir una respuesta de estrés al choque
térmico con la consiguiente producción de
proteasas celulares que ocasionan una disminución
en el rendimiento de los productos proteicos.

Para obtener rendimientos óptimos, las

fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un
margen estrecho de temperatura y a ser posible
constante.
• La velocidad de producción de calor debida a la
agitación y a la actividad metabólica de los
microorganismos no se ve compensada por las
pérdidas de calor que resultan de la evaporación,
por lo que se debe recurrir a sistemas de
refrigeración.

• Dentro de éstos, los más utilizados en las

fermentaciones industriales son las camisas de
agua.
3.- pH .- La mayor parte de los microorganismos
crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante
el crecimiento en un fermentador, los metabolitos
celulares son liberados al medio, lo que puede
originar un cambio del pH del medio de cultivo.

Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de

cultivo y añadir un ácido o una base cuando se
necesite para mantener constante el pH.

La adición del ácido o base debe ser mezclada

rápidamente de tal manera que el pH del medio de
cultivo sea el mismo en todo el fermentador.
El MEDIO AMBIENTE puede considerarse en tres
aspectos: BIOLOGICO & QUIMICO & FISICO

AIREACION Y AGITACION.

La agitación es necesaria para:

1- incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno
desde las burbujas de aire al medio líquido; los
microorganismos no pueden utilizar oxígeno gaseoso, sino
solamente el que se encuentra en disolución.

2- aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y

nutrientes desde el medio a las células. Debido al
movimiento se evita que las células creen áreas estancadas
con bajos niveles de oxígeno y nutrientes.
3- impedir la formación de agregados celulares.
4- aumentar la velocidad de transferencia de
productos metabólicos de las células al medio.
5- aumentar la tasa o la eficiencia de la
transferencia de calor entre el medio y las
superficies de refrigeración del fermentador.
V. AGITACION Y MEZCLADO.- La agitación es la
operación que acelera el contacto entre dos o varias
fases. Una fermentación microbiana puede ser
considerada como un sistema de tres fases, que
implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-
líquido.

1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos

y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una
segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible
en agua como por ejemplo los alcanos.

2.- La fase sólida consiste en células individuales,

bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos
del metabolismo que precipitan.

3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el

suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2 o
Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es
esencial para la fermentación ya que produce los
siguientes efectos en las tres fases:

1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes.

2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y
concentración de nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensión de los microorganismos y de los
nutrientes sólidos.
4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles.

Cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento.

la agitación excesiva puede romper las células grandes e
incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso
en la viabilidad celular. Se debe conseguir un balance
entre la necesidad del mezclado y evitar el daño celular.
Ingeniería de
Biorreactores
•Configuración
•Tamaño
•Condiciones del proceso
•Modo de operar
Los tipos de agitación que se utilizan en las
fermentaciones se incluyen dentro de las clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema
interno mecánico de agitación.

2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza

mediante la introducción de aire a sobrepresión.

3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener

un circuito interno o externo. La mezcla y circulación
de los fluidos son el resultado de las corrientes de
aire introducido, las cuales causan diferencias en la
densidad dentro de las diferentes partes del
fermentador.
Biorreactores:
Configuración
• Tanque agitado.
• Columna de burbujeo.
• Air lift.
• Lecho empaquetado.
• Lecho fluidizado.
• Lecho de goteo.
• Fibra hueca.
Biorreactor típico en tanque agitado para cultivo aerobico
Fig. Configuraciones de reactores Airlift
Disposición de Baffles
(a) Baffles adheridos a la
´pared para líquidos de
baja viscosidads.
(b) Baffles set away from the
wall for moderate-
viscosity liquids.
(c) Baffles set away from the
wall and at an angle for
high-viscosity liquids.
Fig. Diseño de impulsores .
• Flujo Circular.
• Flujo Axial.
• Flujo Radial.

• Depende de:
– Diseño de la paleta.
– Propiedades el fluido.
– Tamaño y proporciones del recipiente, bafles
y agitador.
(a) Flujo Circular en un
Tanque agitado sin
Baffles
(b) Formacion de
vortice durante el
flujo circular .
Fig. modelo de Flujo producido por un impeller de flujo radial en
un tanque bafleado tank. (a) Vista lateral (b) Vista de fondo .
Fig. Modelo de Patron de Flujo producido por un impeller de
flujo axial en un tanque baffleado (a) Vista lateral (b) vista de
fondo .
 Transmisión De Calor

•Calentamiento (vapor).
•Enfriamiento (agua de refrigeración).
 Columnas De Burbujeo
• El flujo depende de:

− Caudal de aire.

− Diseño del difusor.

− Diámetro de la columna.

− Propiedades del líquido.

 Columnas De Burbujeo

• Estructura sencilla.
• Agitación por inyección de aire.
• Bajo shear.
• Adecuado rendimiento de
• transferencia de materia
• y calor.
• Bajo costo.
• Usos:
• Producción de levaduras
• de panificación, cerveza,
• vinagre, tratamiento de
• aguas residuales.
Recuperación de
productos
 Extracción de un producto
deseado

• A menudo es liberado al medio en

pequeñas concentraciones
• Otras veces está dentro de la célula
• El medio inicialmente contiene
nutrientes de bajo peso molecular o
de alto peso molecular, a veces
junto con partículas en suspensión
• El peso molecular del producto
puede ser bajo o alto
• Su concentración puede ser variable
 Algunos nutrientes en fermentaciones

Substanci P.M. (g/L)

a
Glucosa 180 50
Urea 60 5
(NH4)2SO4 132 2
KH2PO4 136 1
Ext. Levad. - 5
Soya meal - 10
 Algunos productos en fermentaciones

Substanci P.M. (g/L)

a
Amilasa 48,900 20
Vitamina 1375 0.023
B12
Sulfato de 582 4
streptomici
na
Glutamato 169 35
de sodio
 Esquema general para la recuperación de productos
solubles extracelulares

cultivo fracción producto

Remoción extracción diluído concentración
soluble
producto
concentrado

purificación
Células y otros impurezas
Materiales insolubles

Producto puro
 Remoción de insolubles

• El material insoluble
representa el 10% o más del
cultivo
• Se separa primero
 Principales métodos para la remoción de insolubles

gravitacional mecánico acción eléctrico

superficial

centrifugación adsorción flotación

floculación
intercambio iónico

filtración dialisis

electroforesis electrodialisis
electroosmosis
 Centrifugación

• La remoción de levaduras como

bacterias puede ser afectada por la
centrifugación
• De acuerdo a la ley de Stokes, la
velocidad de sedimentación de
partículas esféricas en un fluido
newtoniano es proporcional al
cuadrado del diámetro de la partícula
(célula microbiana)
• Los factores que influencian la
precipitación durante la
centrifugación son la diferencia de
densidades entre las células y el
líquido, el diámetro de la célula y la
viscocidad del líquido
Dimensiones de los microorganismos y método de
centrifugación

Microorga Diámetro Método de

nismo (micras) centrifuga
c.
Virus, fagos 0,01-0,1 ultracentrif
ugación
Bacteria 0,3-3,0 Normal

Levadura 4,0-7,0 Normal

Moho 100-150 Normal

 Centrifugación

• Debido a que las bacterias son

aproximadamente 1/5 más
pequeñas que una levadura, se
requiere una fuerza de
centrifugación 25 veces mayor
para separarlas
• La centrifugación también se aplica
para la separación de líquidos
parcialmente emulsificados de
diferentes densidades
 Floculación

• La producción de flóculos se produce

por la neutralización de las cargas de
la superficie celular
• Las células bacterianas y de
levaduras cuando están en un medio
de pH neutro presentan una carga
negativa por la presencia de grupos
carboxilos y fosfatos sobre sus
paredes
• La floculación es influenciada por las
características de la pared celular, el
entorno iónico, el pH del medio y el
agente floculante usado
Propiedades deseables en un
agente floculante

• Reacción rápida con la célula

• Ausencia de toxicidad
• Mínima alteración de los
constituyentes celulares o productos
• Ausencia de marcada alcalinidad ó
acidés y capacidad de actuar a un pH
cercano al neutro
• Bajo costo y/o alta actividad a baja
concentración
• De fácil separación del producto final
 Agentes floculantes

• Sulfato de aluminio (0,1-0,5%)

• Cloruro de calcio (0,1-0,5%)
• Tetracloruro de titanio (0,01-0,02%)
• Detergentes catiónicos como
compuestos cuaternarios de amonio,
alquilaminas y sales de
alquilpiridium (0,01-1,0%)
• Polielectrolitos aniónicos y no iónicos
(poliacrilamida, sulfato de
poliestireno, ácido poliglutámico)
• Polímeros hidrofílicos como gelatina,
carboximetil celulosa y dextrano
 Filtración

• Este método se usa para la

separación de micelio fúngico o de
actinomicetos
• El micelio frecuentemente produce
el bloqueo del filtro y requiere de la
adición de tierra de diatomea,
perlitas, asbesto, o pulpa de
celulosa
• La filtración es más económica que
la centrifugación
 Flotación

• Este proceso depende de la tendencia

de las partículas en suspensión en un
líquido de fijarse a las burbujas de gas
• Un gas, normalmente aire, se inyecta
desde el fondo de un fermentador; las
burbujas se elevan con las partículas
adheridas, formando una espuma en
la superficie que puede ser removida
rapidamente
• Este proceso se llama microflotación
 Flotación (ejemplos)

• E. coli con un detergente catiónico

(bromuro de etil hexadecil metil
amonio, 0,04 mg/ml); la proporción
de enriquecimiento puede ser del
orden de 106
• Bacillus. Las esporas pueden ser
concentradas por flotación con
aminas secundarias y las células
vegetativas con ácidos grasos
• Algas filamentosas. Se aprovecha el
oxígeno producido por fotosíntesis
 Extracción, concentración y
purificación de productos
solubles

• Cuando el producto esta disuelto

en una fase líquida del cultivo, el
problema es encontrar un
método conveniente para
obtener este producto en una
forma concentrado, libre de
constituyentes del medio y otros
productos de la fermentación
que no interesan.
 Extracción con solventes

• La elección de un solvente
depende del producto
k = Cs
Ce
Cs = concentración en la fase
solvente
Ce = concentración enb la
fase acuosa
• El valor de este coeficiente de
partición varía con el pH, que
debe ser ajustado para
asegurar la extracción
• Los solventes orgánicos
empleados (alocholes, ésteres,
cetonas, éteres, hidrocarburos)
son usualmente costosos e
inflamables
 Adsorción y elución

• El compuesto a ser separado,

usualmente en baja concentración
en solución acuosa, se absorbe en
un sólido apropiado, usualmente en
forma de columna y, luego es eluído
con un buffer a un pH apropiado
• Se usan columnas de hidróxido de
aluminio, polvo de celulosa, carbón
activado, sílica ó resinas de
intercambio iónico
 Precipitación

• Algunos productos pueden

precipitarse adicionando un
solvente orgánico miscible en
agua ó un agente que causa
la formación de un complejo
insoluble o sales
 Intercambio iónico líquido

• La extracción con solventes tiene la

ventaja que se opera como un
proceso contínuo
• Sin embargo, a gran escala, las
resinas de intercambio iónico son
más económicas ya que el costo de
regenerarlas es menor que el costo
de recuperar solventes
• Las técnicas de intercambio iónico
líquido combina algunas de las
ventajas de los dos métodos
Uso del intercambio iónico líquido
para la extracción de un producto
aniónico P dela fase acuosa de un
cultivo líquido

Fase orgánica

R3NHA + P- R3NHP + A-

P- A-

Fase acuosa
 Filtración en gel

• Este método funciona para

separar moléculas de
diferentes tamaños
• Los geles (dextranos,
poliacrilamidas ó derivados de
poliestireno) son dispersados
en una fase acuosa, formando
una columna tridimensional
 Métodos que usan
membranas

cultivo ZA Membrana Eluyente XA

YA < ZA

Retenido YA
YA > ZA
 Clasificación de los métodos
de separación con
membranas

Efecto de Efecto de Efecto de

concentración campo eléctrico presión

Ósmosis
Diálisis por ultrafiltración
Osmosis reversa
evaporación

electrodiálisis electroósmosis
 Productos intracelulares

• Algunas veces es posible extraer los

productos intracelulares modificando
el pH o usando solventes como el
cloroformo
• Cuando el producto es menos
estable (por ejemplo enzimas) es
necesario romper la pared celular,
aplicar shock térmico, shock
osmótico, congelamiento alternado,
ultrasonido
• La extracción subsecuente varía de
acuerdo al producto y al grado de
pureza que se requiere