Teknologi dna rekombinan

(GENETIC ENGINEERING)

DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Teknik Rekombinan meliputi:

-Teknik untuk mengisolasi DNA

-Teknik untuk memotong DNA.
-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.
-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup
sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan
dapat diekspresikan
Organisme transgenik:
organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis
organisme lainnya.

Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan

kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen secara buatan.
 Apa Rekayasa Genetika?
Definisi:
 Teknik perubahan genetik suatu organisme, atau
keturunan, untuk menghilangkan karakteristik bahan
yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan
bahan yang baru yang diinginkan.

 Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal

dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang
diinginkan
- Isolasi dan pemurnian DNA
• Isolasi DNA bakteri
• Isolasi DNA plasmid
• Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis

- Berbagai jenis dan karakterisasi vektor

• vektor plasmid
• vektor yeast
• vektor bakteriofag

- Enzim restriksi dan ligase

• Jenis enzim restriksi
• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi
• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase
Teknik Elektroforesis dan PCR
• Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis
• Faktor yang berpengaruh terhadap PCR

DNA sekuensing dan hibridisasi

• southern blot
• northern blot
• western blot

DNA rekombinan dan Transformasi

• Isolasi
• Restriksi
• Sel kompeten
• Transformasi
Rekayasa genetik pada :
• hewan
• tumbuhan
• manusia

Produk transgenik, keamanan dan bioetika

• Biosafety
• bioetika
• GMO dan genetically modofied foods
Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai
teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah
gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan
Genetically Modified Organism (GMO) dengan
genotipe baru

Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan

gen asing dari satu spesies menjadi
- spesies lain,
- membentuk organisme transgenik;
- mengubah gen yang ada sehingga produknya berubah,
- mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih sering atau tidak
sama sekali
 MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional

seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman
→ terlalu lambat

Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme
dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
• Kloning gen untuk menentukan fungsinya
• Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan

 Rekayasa genetika dengan teknik molekuler

• Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar
pada kecepatan yang jauh lebih cepat
• Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar
 Teknik Dasar Rekayasa Genetika

 Selective Breeding
Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak digunakan untuk
pemuliaan lebih lanjut

 Hybridization (Crossbreeding)
Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik
dari keduanya.
(burung dara + perkutut = sinom)
 Recombinant DNA Technologies
Transformasi
Basic steps in genetic engineering
1. Isolasi gen
2. Insersi ke dalam host menggunakan vector
3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin
4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan
5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan
 Fluorescent proteins are a useful tool
in biotechnology
 Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam
sel-sel hidup suatu organisme

 Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein (GFP) pertama

kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir
semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi
fluorescent molecule.

 Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-

karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih
memahami peristiwa selular.

 Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

 Hewan Transgenik

 Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan

tubuh dan penyakit genetik

 Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk

transplantasi

 Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

 Organisme rekombinan

 Tanaman tahan hama

 jagung (gen toksin dari Bacillus thuringiensis
yang dapat membunuh serangga)
 Tanaman tomat
 Golden rice (beta-carotene)
 Plant-based vaccines
 Genetically Modified Organisms

 Tanaman tahan hama

 Jagung Bt (mengandung gen toksin dari Bacillus
thuringiensis yang membunuh hama)
 Golden rice (mengandung beta-carotene)
 Tanaman sebagai vaksin
 Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)
 Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants

 Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying

insecticide
Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila
memakan jagung
 Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman
“Golden Rice” mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A

 Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti

vitamin A dan precursornya (β-carotene).
 Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan
penurunan sistem imun tubuh.
HUMAN GENETIC ENGINEERING
 Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen dalam sel manusia yang
hidup

 Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang
cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan
akan sembuh .

 Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan
ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang
memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya
HUMAN GENETIC ENGINEERING
"Somatic "genetic engineering
 Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ tertentu dan jaringan
tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.
 Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil
yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat
digunakan dengan efektif
"Germ line" genetic engineering

 Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam telur, sperma, atau

embrio sangat awal
 Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam tubuh individu yang
dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnya

[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body."
The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs
and sperm.
Produk DNA Recombinant untuk terapi
pada manusia

• Insulin (diabetics)
• Factor VIII (males w/hemophilia A)
• Factor IX (hemophilia B)
• Human growth hormone
• Erythropoietin (anemia)
• Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)
• leptin
DESIGNER
BABY
 Kesulitan pada Rekayasa Genetika
Manusia

 Inserting gene in correct cells

 Inserting gene so it is expressed correctly
– Orientation
– Regulation
 Controlling virus vector
 Ethical issues
KLONING GEN
Kloning - definisi
 Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
 Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan
replika sebagian atau seluruh makromolekul
(contoh, DNA atau antibodi)
 Suatu individu yang tumbuh dari satu sel
somatik induknya serta memiliki identitas
genetik yang sama dengan induknya
 Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua
identitasnya sama dengan molekul atau sel
penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
Kloning Gen
 Ketika keseluruhan
DNA dari suatu
organisme diekstraksi,
akan diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
 Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)
Tujuan mengklon Gen
 Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
gen tersebut
 Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut
 Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang
disandi gen tersebut
 Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan
 Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnya memproduksi insulin, ketahanan
terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk diklon
 DNA kromosom
 cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
 DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
 Bahan / Alat untuk Mengklon
 Enzim endonuklease restriksi
 Enzim ligase
 Vektors
 Inang (Host)
 Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
 Memotong DNA
 Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
 Ujung “lengket” (sticky ends)
 Ujung “tumpul” (blunt ends)

 Penamaan enzim
 EcoRI
 E = genus (Escherichia)
 co = species (coli)
 R = strain
 I = # of enzyme
Penyambungan (pasting) DNA
 Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)

 Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA tersebut
dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
Vektor untuk Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
 1. Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang
secara alami dimiliki suatu jasad
 Bentuknya benang ganda (double strands DNA,
dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat

dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
Vektor untuk Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
 Replikator (origin of replication)
 Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
 Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan
tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk
binatang lain
 Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu
enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki
ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
 Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA
asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"
 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel
inang yang sesuai
Vektor berupa Plasmid
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
 Vektor berupa Plasmid
 Keunggulan:
 Kecil, mudah pengerjaannya
 Strategi seleksi mudah
 Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
 Kelemahan:
 Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)
2. Bakteriofaga (l phage)
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
 Lengan kiri:
 Protein penyusun kepala
& ekor
 Lengan kanan:
 Sintesis DNA
 Pengendalian
 Lisis inang
 Daerah yang dihilangkan:
 integrasi & eksisi
 Pengendalian
 Vektor berupa Bakteriofaga

 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Kelemahan:
 Lebih sulit pengerjaannya
3. Vektor Cosmid

 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Pengerjaan seperti plasmid
 Kelemahan:
 Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50
kbp)
Vektor Cosmid
4a. Vektor BAC
 Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
 parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
 Menggunakan penanda
ketahanan terhadap
KhloramfenikolR
4b. Vecktor YAC
large
inserts

ARS URA3 HIS3

telomere centromere markers telomere
replication
origin

 Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp

dan dimasukkan ke dalam yeast
 BACs dan YACs
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
 Keunggulan:
 Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan
ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
 Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom
 Kelemahan:
 Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran
sangat besar
Memilih Vektor
 Ukuran DNA yang
disisipkan
 Ukuran vektor
 Situs enzim restriksi
yang tersedia
 Jumlah salinan (copy
number)
 Efisiensi kloning
 Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
 Rencana penelitian
selanjutnya
 Cara Mengklon
 Isolasi vektor kloning (plasmid
DNA (1)
bacterial) & DNA sumber gen
 Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning menggunakan
enzim restriksi yang sama
 Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
 Cara Mengklon DNA (2)
 Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
 Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
 Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah disisipi
gen) ke dalam sel inang
Transformasi
 PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan
kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2).
Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel
bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap
plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi
 INKUBASI
 Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel
E. coli kompeten.
 Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang
tidak ditambah plasmid digunakan sebagai
kontrol.
Transformasi
 KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu
42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya
plasmid menembus membran dan dinding sel.
Transformasi
 PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi
untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu
generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45
menit)
Transformasi
 PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan
ditapis pada medium padat yang mengandung
senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa plasmid
dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)
 Penapisan Klon
 Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang digunakan
sebagai penanda, misalnya
Kanamisin
 Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid dengan
penanda ketahanan
terhadap Kanamisin(Kanr),
yang di sebelah kiri tidak
memilikinya
Manfaat

Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu

pengetahuan maupun dibidang terapan.

Contoh:
Bidang Kesehatan:

Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri