INTRODUCCIÓN

El presente trabajo vamos a diferenciar los dos tipos de métodos

ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y
fosforescencia molecular. En todos ellos, las moléculas del analito
se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión
suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo.
Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos
luminiscentes moleculares.
 FUNDAMENTO

Para que una sustancia origine emisión foto-luminiscente

es necesario que previamente tenga lugar la absorción de
radiación electromagnética, mayormente tienen lugar
entre los orbitales π enlazantes y antienlazantes (π—>π*)
que son las de mayor interés en los procesos
luminiscentes.
 En la luminiscencia se consideran 3 tipos de
métodos ópticos relacionados entre sí:

En todos ellos, las

A estos métodos
moléculas de analito se se le conoce
*FLUORESCENCIA excitan para dar una
*FOSFORESCENCIA colectivamente
especia cuyo espectro
MOLECULAR de emisión suministra como
*QUIMIOLUMINISCENCIA información para un procedimientos
análisis cuantitativo y luminiscentes
cualitativo.
moleculares.
 LUMINISCENCIA
• Es todo proceso de emisión de luz cuyo origen no radica
exclusivamente en las altas temperaturas, es una forma de "luz fría"
en la que la emisión de radiación lumínica es provocada en
condiciones de temperatura ambiente o baja.
 TIPOS DE LUMINISCENCIA
• Fluorescencia
Que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma
de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma
de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.
• Fosforescencia
Fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber
energía y almacenarla, para emitirla en forma de radiación.
A los elementos que ofrecen fosforescencia se les conoce como foto-reactivos.
• DIFERENCIA:
• *Fluorescencia: Las transiciones electrónicas responsables no conllevan un
cambio en el espín del electrón; presenta una vida corta .
*Fosforescencia: Hay un cambio en el espín del electrón.
• Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia
Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere
una revisión del spín del electrón y de los estados excitados singulete /
triplete.
• Espín del electrón
Establece que en un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro
números cuánticos iguales. No debe de haber más de dos electrones en
un orbital y los dos deben tener los estados de espín opuestos. Espines
están apareados.
• Estados excitados singulete/triplete
Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los
electrones están apareados se llama singulete y cuando la molécula se
expone a un campo magnético no se produce un desdoblamiento de
niveles de energía.
 TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA
La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos, tanto
sencillos como complejos.
El tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores
atómicos diluidos. Por ejemplo:
Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser
excitados al estado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes
de onda de 5 896 a 5 890 Å.
Después de 10−8 𝑎 10−5 s, los electrones vuelven al estado fundamental
emitiendo radiación de estas mismas longitudes de onda en todas las
direcciones.
Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida
sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o
fluorescencia de resonancia.
 PRINCIPIO DE EXCLUSIÓN DE
PAULI
• No pueden haber 2 electrones con los
mismos números cuánticos; por lo tanto
solo 2 electrones en un mismo orbital con
espines opuestos.

• Electrones apareados o no apareados.

• Las moléculas con espines apareados no
presentan un campo magnético: son
diamagnéticas (no se alteran en un campo
magnético).

• Las moléculas con electrones

desapareados (radicales libres) presentan
un campo magnético: son paramagnéticas
(se alteran en un campo magnético).
• Singulete: estado electrónico molecular
con todos los espines apareados.

• Doblete: estado electrónico molecular

donde el electrón impar puede tomar dos
orientaciones.
 PROPIEDADES
• Una molécula es paramagnética en estado
triplete y diamagnética en estado singulete.
• Es más probable una transición singulete-
singulete que una singulete-triplete.
• Tiempo de vida de un estado triplete excitado
desde10-4 a varios segundos.
• Tiempo de vida de un estado singulete excitado
es 10-8 a 10-5 segundos.
Rendimiento cuántico o eficiencia cuántica de
fluorescencia o de fosforescencia

Es la relación entre el número de moléculas que

emiten luminiscencia respecto al número total
de moléculas excitadas.

Moléculas altamente fluorescentes (fluoresceína)

eficacia cuántica se aproxima a la unidad; en las
poco fluorescentes se aproxima a cero.
 FLUORESCENCIA Y ESTRUCTURA
La fluorescencia más intensa y la más útiles la que presentan los compuestos que contienen
grupos funcionales aromáticos con transiciones  * de baja energía. Los compuestos que
contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles
enlaces altamente conjugados también pueden presentar fluorescencia, pero el número de
estos compuestos es pequeño comparado con el número de sistemas aromáticos.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución,
la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de
condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol.
no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con
éstas normalmente sí la presentan. En los heterociclos con nitrógeno, se cree
que la transición electrónica de más baja energía implica a un sistema n * que
rápidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
Sin embargo, la condensación de anillos bencénicos para dar núcleos
heterocíclicos, da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de
absorción. En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es más
corto, así, se observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la
isoquinolina y el indol.
PRESENTAN FLUORESCENCIA NO PRESENTAN FLUORESCENCIA
 EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y DEL
DISOLVENTE

• La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia del

disolvente
• Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con
frecuencia a los disolventes compuestos que contienen átomos
pesados
• Disminuye en la mayoría de moléculas al aumentar la temperatura
 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN EN LA
INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA.
Ley de Beer

Po=potencia del haz incidente

Serie de
P=potencia del haz transmitido
Maclaurin
ε=absortividad
b=espesor de la cubeta (camino óptico)
C=concentración
 INSTRUMENTACIÓN
Los distintos componentes de los instrumentos para la
medida de la fotoluminiscencia son similares a los que
se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros
ultravioleta/visible. La siguiente gráfica muestra una
configuración característica de estos componentes en
los fluorómetros y los espectrofluorímetros. Casi todos
los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de
doble haz tal como se muestra, para compensar las
fluctuaciones en la potencia de la fuente.
 COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFLUORÍMETROS
Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren
sólo en detalles de los que componen los fotómetros y los
espectrofotómetros; sólo es necesario considerar estas diferencias.
FUENTES
En la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensa que las
lámparas de wolframio o hidrógeno utilizadas en las medidas de absorción.
De hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es
directamente proporcional a la potencia de la fuente Po
LÁMPARAS.
La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de arco
de mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida. Esta
fuente emite líneas útiles para producir la excitación previa a la
fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las líneas individuales
se pueden aislar con filtros de interferencia o absorción adecuados. Ya que,
en la mayoría de los compuestos fluorescentes, la fluorescencia se puede
inducir con distintas longitudes de onda, al menos una de las líneas del
mercurio suele resultar adecuada.
LÁSERES.
Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de
bombeo, un láser de nitrógeno pulsante o un láser de Nd:YAG.
La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas) como
fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser

ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son
muy pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la

cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2) en los sensores de control remoto, como
en la detección fluorimétrica de radicales hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos

acuáticos, donde la naturaleza colimada de los haces de láseres vital: o (3) cuando se requiere
una radiación de excitación altamente monocromática para minimizar los efecto de las
interferencias fluorescentes.
FILTROS Y MONOCROMADORES
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han
utilizado en los fluorómetros para la selección de la longitud de
onda del haz de excitación y de la radiación fluorescente
resultante, mayoría de los espectrofluorímetros están equipados
con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.

DETECTORES
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su
medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos
fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos de
fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de
fotones para mejorar la relación señal/ruido. También se utiliza, a veces, la
refrigeración de los detectores para mejorar la relación señal/ruido.
CUBETAS Y COMPARTIMENTOS PARA LAS CUBETAS
Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como
rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el
diseño del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación
dispersada que llega hasta el detector. Con este propósito, a menudo se
introducen deflectores en el compartimento incluso más importante que en las
medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas y, a
que la grasa de la piel con frecuencia fluórese.
 APLICACIONES
Determinación de:
•Especies inorgánicas (cationes que forman
quelatos fluorescentes).
•Especies orgánicas y bioquímicas (ácidos
nucleicos, aminoácidos, enzimas, hidrocarburos,
etc.).
•Cromatografía.
•Análisis de gases (métodos quimioluminiscentes).
•Detección de sangre en ciencias forenses
(luminol, hemasceína, etc.)
 • Determinación de
sustancias inorgánicas
• Cationes que forman
quelatos fluorescentes
• Descenso de fluorescencia
Otras
Aplicaciones • Determinación de
sustancias orgánicas
• Fármacos y drogas.
• En Química Agroalimentaria
• Contaminación ambiental
LAS VENTAJAS PRINCIPALES DE ESTE MÉTODO
a) Su sensibilidad, uno o dos órdenes de magnitud mayor
que la espectroscopia de absorción.

b) Los intervalos lineales, los cuales son más grandes que en

la espectroscopia de absorción.

c) Se pueden detectar concentraciones muy pequeñas de

moléculas orgánicas.

d) El agua es transparente a radiación UV y VIS. Se pueden

analizar las moléculas biológicas en soluciones acuosas sin
interferencia del solvente.
LAS DESVENTAJAS PRINCIPALES DE ESTE MÉTODO

 Generalmente no se obtiene una información

detallada de la estructura de la molécula.
 La fluorescencia es muy sensible para analizar
cambios estructurales de macromoléculas, pero su
intensidad es afectada por la temperatura. No sirve
para estudiar cambios dependientes de
temperatura.

 Debido a la sensibilidad de la espectroscopía de

absorción UV y VIS, la muestra debe tener una
pureza muy alta.
 CONCLUSIONES

• La espectroscopia de luminiscencia molecular no va permitir la

determinación de sustancias orgánicas e inorgánicas
• La diferencia entre la fluorescencia y fosforescencia es, en la
fluorescencia las transiciones electrónicas responsables no
conllevan un cambio en el espín del electrón y presenta una vida
corta, mientras en la fosforescencia hay un cambio en el espín del
electrón.
 BIBLIOGRAFÍA

• Principio de Análisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN

Quinta Edición. Mc Graw Hill.
• Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.