Nutrición microbiana.

Condiciones generales
para el cultivo de microorganismos

CION )
RMA (adn
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INF ETIC
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GE
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman
del medio donde habitan las sustancias químicas que
necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan
nutrientes, y se requieren para dos objetivos:

fines energéticos (reacciones de mantenimiento);

fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son

procesos que requieren energía procedente del medio
ambiente.

La nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de

energía y otro de suministro de materiales para la síntesis
celular.
 Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de
energía, se pueden dividir en:

a) Litotrofas: son aquellas que sólo requieren

sustancias inorgánicas sencillas (SH2 S0, NH3,
NO2-, Fe, etc.).
b) Organotrofas: requieren compuestos
orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos,
lípidos, proteínas, alcoholes...).
 Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades
plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

a) Autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a

partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien,
habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la
capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono,
a saber, el CO2.
b) Heterotrofas: su fuente de carbono es orgánica (si
bien otros elementos distintos del C pueden ser
captados en forma inorgánica).
Sean autótrofas o heterótrofas, todas
necesitan captar una serie de elementos
químicos, que se pueden clasificar (según
las cantidades en que son requeridos) como

macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y

micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn,

Mo...)
 Clases de nutrientes
 Universales (los requeridos en esta forma por todos
los procariotas): H2O, CO2, fosfatos y sales minerales
 Particulares: elementos que se pueden captar de
diferentes maneras, según especies: N y S.
 Especiales: los microorganismos pueden tener
necesidades especiales. Ej:
– Las bacterias halófilas requieren grandes
cantidades de Na (mares)
 Factores de crecimiento
 El agua
• El agua es:
– el principal constituyente del protoplasto
bacteriano;
– el medio universal donde ocurren las reacciones
biológicas;
– un reactante en exceso (es decir, un producto
resultante de algunas reacciones bioquímicas).
• Fuentes de agua:
– endógena (procedente de oxido-reducciones)
– exógena (la mayoría) procedente del medio, y que
difunde a través de las membranas.
 El agua
• La disponibilidad de agua se mide como actividad de agua
(potencial de agua; aw)

aW= PS/PW .

Donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es

la presión parcial de vapor del agua destilada.

• Las bacterias tienen valores de aw normalmente entre 0.90 y 0.99

– en bacterias que viven en sangre y fluidos, aw = 0.995
– en bacterias marinas. Vibrio, Pseudomona aw = 0.980
– microorganismos xerófilos (aw en torno a 0.75)
arqueas halófilas extremas (Halobacterium)
levaduras sacarófilas, que viven en zumos y jugos
 El Carbono
El C es necesario para construir el esqueleto
de todas las moléculas orgánicas
• Autótrofos: pueden usar CO2 como única
fuente de C
• Heterótrofos: emplean moléculas orgánicas
preformadas y reducidas como fuente de C
Los microorganismos tienen gran flexibilidad con
respecto a la fuente de C
 El CO2
 El CO2 es requerido por todo tipo de bacterias.
Los autotrofos lo requieren como fuente de C, y lo reducen
usando como fuente de energía
○ sustancias químicas : quimioautotrofos
○ la luz: fotoautotrofos

Las arqueas metanogénicas lo pueden usar como aceptor final

de electrones en la respiración, produciendo CH 4. Además,
algunas lo usan también como fuente de C

Los heterotrofos necesitan pequeñas cantidades de CO2 para sus

carboxilaciones en rutas metabólicas
 El CO2
 El origen del CO2 puede ser:

Endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren

al degradar la fuente orgánica de carbono

Exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las

soluciones acuosas

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2

atmosférico (0.03%), pero algunas bacterias (Neisseria,
Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren
atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. (capnofilia o
microaerofilia)
 Fosfatos
 El P suele requerirse en forma de fosfatos
Bacterias que usan fosfatos orgánicos poseen fosfatasas
extracelulares (secretadas) en Gram-positivas, periplásmicas
en Gram-negativas
Fosfatos inorgánicos
Las bacterias que usan fosfatos orgánicos no dependen de ellos, ya que
también pueden usar fosfatos inorgánicos

 El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los

ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece
también en coenzimas y en proteínas.
 Sales minerales: cationes
 Ion Potasio K+
en activación de enzimas
asociado con Ac. teicoicos de Gram+

 Ion Magnesio Mg2+

estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos
cofactor en reacciones con ATP
en clorofilas y bacterioclorofilas

 Ion Calcio Ca2+

cofactor de enzimas como proteinasas

 El Hierro como ion Fe2+

en citocromos, FeS-proteínas
cofactor en enzimas
Oligoelementos o micronutrientes
 Mn2+ (cofactor de ciertas enzimas)
 Co2+ (vitamina B12)
 Zn2+ (estabiliza ADN-polimerasas y ARN-
polimerasas)
 Mo (en molibdoflavoproteínas, en la
asimilación de nitratos. Cofactor en el complejo
nitrogenasa)
 Ni (en hidrogenasas, enzimas que captan o
liberan H2)
 Nitrógeno y azufre
Los elementos N y S son requeridos por todos los
seres vivos, se encuentran en la célula en estado
reducido:
 El -NH2 forma parte de los aminoácidos y de las bases
nitrogenadas
 El radical –SH interviene en aminoácidos y coenzimas
 Factores de crecimiento
• Son moléculas orgánicas, componentes celulares esenciales, que
no pueden ser sintetizados por el microorganismo, los toman del
ambiente, y son requeridos en muy pequeñas cantidades

• Existen 3 clases principales

– Aminoácidos: síntesis de proteínas
– Purinas y pirimidinas: síntesis de ácidos nucleicos
– Vitaminas: cofactores enzimáticos

Ejemplos:
– Brucella requieren biotina, niacina, tiamina y pantoténico
– Haemophilus necesita hemo y piridín-nucleótidos
 CULTIVO DE MICROORGANISMOS

• PROVEER UN MEDIO ADECUADO PARA EL

CRECIMIENTO
 Crecimiento y formación de
productos
Sustrato para el
crecimiento

Células Metabolito
(Biomasa X) primario

Sustrato para el
crecimiento Sustrato para el
crecimiento

Células Metabolito
primario Células Metabolito
primario

Metabolito Metabolito
Secundario secundario
 Métodos de cuantificación del
crecimiento
- Directos: apuntan a las células

- Indirectos: relacionadas cuantitativamente con el

consumo de nutrientes

Por qué cuantificar?

TABLA N° 01: Métodos para la cuantificación del crecimiento de poblaciones microbianas a
Métodos Fundamento Observaciones
En base al número de células
Recuento en directo Conteo directo en celda Requiere células individuales y medio limpio
Recuento en placa Conteo de colonias Requiere células individuales, gran influencia de
las condiciones de incubación, demora al
menos 24 h
Nefelometría Dispersión de la luz Requiere cultivo homogéneo traslucido
N.M.P (número mas probable) Estadístico Requiere células individuales y medio limpio

En base a masa celular

Peso seco Medición directa No admite sólidos en el medio, delicado y largo
Turbidimetría Transmisión de luz Requiere células individuales y medio limpio
Volumen empacado Centrifugación Poco preciso
Físicos y químicos Indirectos, variados: cambios de Métodos aproximados, requieren de gran
viscosidad o pH, análisis de estandarización
componentes celulares, consumo de
nutrientes

Balance de masa Conservación de la masa, Requiere de gran cantidad de datos analíticos y

representación estequiométrica del de sensores en línea
crecimiento microbiano

a
Mayor información en Cooney (1981) y Harris y Kell (1985)
 Crecimiento microbiano
• Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo
apropiado, estos comienzan a dividirse activamente empleando
los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar"
nuevos microorganismos.
• Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de
cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.
• También puede detenerse el crecimiento por acumulación de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.

Hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento

microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de
microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del
medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a
cabo el proceso.
Estequiometria del crecimiento microbiano

El cultivo intermitente en un sistema cerrado:

Cultivo por lotes
Cuando un medio se inocula con células, tiene
lugar una secuencia de eventos llamado ciclo de
crecimiento.
Estequiometria
 Requerimientos nutricionales

a)

Materia
Células
b) Energía
Información Productos

Reproducción celular: a) Formación de nuevas células

b) Requerimientos nutritivos

l  Ca H bOc  m  NH 3  n  O2  q  Cd H eO f N g  r  CO2  t  H 2O  u  Ch H i O j N k
 Composición química de células microbianas

Elemento % en peso, base seca

Bacterias Levaduras Mohos
Carbono 46 – 53 46 – 51 45 – 55
Hidrógeno 6.5 – 7.5 6–8 8 – 12
Oxígeno 18 – 32 28 – 35 18 – 24
Nitrógeno 10 – 14 6 – 10 3–7
Magnesio 0.1 – 0.5 0.1 – 0.5 0.1 – 0.3
Fósforo 2.0 – 3.0 0.8 – 2.6 0.4 - 4.5
Azufre 0.1 – 1.0 0.01 – 0.24 0.1 – 0.5
Calcio 0.01 – 1.1 0.1 – 0.3 0.1 – 1.4
Potasio 1.0 – 4.5 1.0 – 4.0 0.2 – 2.5
Hierro 0.02 – 0.2 0.01 – 0.5 0.1 – 0.2

Compuesto
Proteínas 45 – 60 35 – 45 25 – 40
Carbohidratos 6 – 15 30 – 45 40 – 55
Lípidos 5 – 10 5 – 10 5 – 10
Ácidos nucleicos 15 – 25 5 – 15 2 – 10
Cenizas 4 – 10 4 – 10 4 - 10
 Composición elemental de la bacteria Escherichia coli

Elemento % de la Elemento % de la masa

masa seca seca

C 50 K 1.0
H 8 Na 1.0
O 20 Ca 0.5
N 14 Mg 0.5
P 3.0 Fe 0.2
S 1.0 otros 0.5
Cuando no se conoce la composición elemental de las células

% P/P
C 46.5
H 6.49
0 31.0
N 10.85
Sales Aprox 5

l  Ca H bOc  m  NH 3  n  O2  q  Cd H eO f N g  r  CO2  t  H 2O  u  Ch H i O j N k

Balance de carbono
Balance de Nitrógeno
Balance de oxigeno
Balance de Hidrógeno
Rendimiento de un nutriente en células

ΔX masa celular producida

YX S  
 ΔS nutriente consumido

dX dS
  YX S
dt dt

dS μX
 
dt YX S
 Ejemplo:
• Para obtener 30 g/l de levadura y 20 g/l de un
metabolito, se consumieron 60 g/l de
nutriente.
l  Ca H bOc  m  NH 3  n  O2  q  Cd H eO f N g  r  CO2  t  H 2O  u  Ch H i O j N k

60 30 20

= 30/60 = 0,5 = 20/60 =

¿ Que debo maximizar o minimizar en el proceso?

 Cinética de cultivo por lotes
El conocimiento de la cinética de crecimiento y de producción de
metabolitos es fundamental en el tratamiento cuantitativo de los
procesos de fermentación. Borzani (1986 y 1986a) ha presentado con
gran claridad sus objetivos y metodologías. El conocimiento de la
cinética de un cultivo permite la predicción del transcurso de la
fermentación, la evaluación de velocidades, rendimientos y
productividades y entrega información útil para establecer estrategias
de producción y optimización del proceso
 Fases de crecimiento

•Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no

se dividen
•Fase exponencial (log) velocidad máxima de crecimiento
bajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo
•Fase estacionaria Ésta se caracteriza por ningún
crecimiento neto. De echo el crecimiento puede estar
ocurriendo, pero esta equilibrado por la rapidez de muerte o
lisis celular.
•Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad
de división celular
 Cinética de crecimiento en cultivo
intermitente

El crecimiento microbiano unicelular es

autocatalítico, es decir la vc es proporcional a X
ya presente. De modo que durante el
crecimiento exponencial, X aumenta como
sigue:
Xo 2Xo 4Xo 8Xo nXo
El intervalo de tiempo se llama tiempo de
duplicación (td), de manera que n después del
tiempo t vale t/td y X vale Xo* 2 t/td
Representación aritmética y exponencial
del crecimiento
 Cinética de cultivo por lotes
Modelamiento del crecimiento celular
El crecimiento de una población bacteriana puede ser representada por:

µ: velocidad específica de crecimiento (h-1, min-1)

Durante la fase exponencial es posible integrar la ecuación (1) resultando:

3
 Cinética de cultivo por lotes

La tabla entrega de valores de td. Estos valores no son ni máximos ni mínimos

sino que cifras típicas

Tipo de Célula td(h)

Bacterias 0.3-2.5
Levaduras 1.0-4.0
Hongos filamentosos 1.5-7.0
Microalgas 18-35
Células animales in vitro 20-40