“CINÉTICA Y REACTORES

ENZIMÁTICOS”

Augusto Castillo Calderón

Ingº Químico – Dr., M.S. Ingeniería Bioquímica
acascal20@hotmail.com
 ENZIMA ENZIMA
EXTRACELULAR INTRACELULAR

Fermentación Fermentación

Torta Separación Separación Caldo

Celular Sólido - líquido Sólido - líquido Gastado

Rompimiento Celular
Concentración
(Extracción)

A purificación Separación Torta

o formulación Sólido – líquido Celular

Concentración

A purificación
o formulación

Fig. Producción de Enzimas

Perfil típico de producción de inulinasa (cuadrados) y número
de células viables (triángulos) por Kluyveromyces S120 en
condiciones óptimas (año publicación 2007)
Estructuras Principales de Enzimas

Lactasa

Origen: Levaduras y fúngico

Acción: hidrólisis Lactosa
pH: 4 – 7
T: 30 – 35 ºC
 Lipasa

Origen: Fúngico
Acción: Hidrólisis de triglicéridos
pH: 2 – 9
T: 30 – 40 ºC
 Invertasa

Origen: Levaduras y fúngico

Acción: Hidrólisis de Sacarosa
pH: 4 – 6
T: 25 -55
 Termodinámico
Acción enzimáticos:
Cinemática
Un modelo por simulación dinámica molecular y un esquema hipotético
para el mecanismo de acción de la inulinasa de B. polymyxa 722
Un modelo por simulación dinámica molecular y un esquema hipotético
para el mecanismo de acción de la inulinasa de B. polymyxa 722
Actividad enzimática: a = ƒ(e)

E
S P

[ ] P

dP _ dS
a = Vt 0 = =
dt t 0 dt t 0
Medición experimental “a”:
Rango de linealidad
“ t ” usuales: 10 – 30/
Emplear un blanco o testigo

Método Analítico: Espectrofotometría

a: Unidades de actividad

Unidad Internacional (U.I.): Cantidad E que cataliza la

transformación de 1 µmol de S por min. en
Condiciones Ambientales Definidas. [S],
pHopt , Topt
Cinética Enzimática:

Principales Variables: e, S, P, I, A
[ pH, T ]

Principio Fundamental: (e)

Diseño y Evaluación de un proceso enzimático:

Expresión matemática para la cinética de
la reacción catalizada.
Catálisis en Fase Homogénea:

( a ) Hipótesis equilibrio rápido ( Michaelis – Menten )

( b ) Hipótesis del estado estacionario ( Briggs – Haldane )

K1 K3
E+S ES E+P
K2

[ ] P

V.S
v=
K+S dc
=0
C dt
S
V = K3 . e
t
Inhibición reversible o Enzimáticos: E
S P1 + P2

a) Inh. Competitiva (P1): KAp = K ( 1 + P )

K1
V
b) Inh. No Competitiva (P2): VAp =
1+P
K2
c) Inh. Mixta o Combinada

Inh. Anticompetitiva

VAp . S
V = VAp y/o KAp ƒ( I )
KAp + S
Ecuación generalizada para generar cualquier
modelo cinético sobre un sustrato:

S P1 + P2

S: Sustrato inhibidor
P1: producto, inhibidor competitivo
P2: producto, inhibidor no competitivo
  k s k Kp 
kes1   
IV 
 k K k K 2 K 
v
 s Kp   s   1 1 p 
s1     K1    Kp
IV 
  
 K K 2 K   K   K1 K 2 K1 K2 

v AP  s
v
K AP  s
v AP y/o K AP : f(i)
Reacciones enzimáticas reversibles: S P

Análisis por hipótesis del e.e.

E  S 
k1
E S 
k3
EP

VS VP P

K KP
V
S P
 1
K KP

k 2  k3 k 2  k3
K ; KP  ; V  k3  e; VP  k 2  e
k1 k4
Determinación experimental de Parámetros cinéticos: V, K

1
v

1
V

1
1
S
K
Determinación Gráfica de Parámetros Cinéticos:

Intercepto Intercepto
Método Eje Y Eje X Pendiente
Eje Y Eje X

Lineweaver - 1/v 1/s 1/VAp - 1/KAp KAp/VAp

Burk

Hanes s/v S KAp/VAp - KAp 1/VAp

Eadie – Hofstee V v/s VAp VAp/KAp - KAp

Integrado (1/t) . ln(si/s) (si/s)/t VAp/KAp KAp - 1/KAp

 Efecto de Parámetros Ambientales
aW
pH
T: ejerce dos efectos contrapuestos “a”

1º K = K0 exp (-Ea / RT); Ea: 4 - 20 Kcal

mol
2º KD = KD0 exp (-Eia/ RT); Eia: 40 - 200 Kcal
mol
KD: constante de inactivación térmica
enzima.

Eia: representa la energía de activación

del proceso de inactivación enzimática.

K: (V/e) constante catalítica, reactividad

del complejo ES.

Ea: energía de activación.

 T ópt: para un proceso enzimático
depende del tiempo de operación.

Para Diseño y Evaluación del comportamiento

de reactores enzimáticos:

Modelo:
de
  KD e
dt
 Cinética de Fase Heterogénea
a) Enzimas Inmovilizadas
Método Proceso Pérdida Estabilidad Costo
inmovilización actividad biocatalizador elaboración
Adsorción Simple baja baja bajo

Enlace covalente complejo alta alta alto

Entrecruzamiento intermedio moderada intermedia moderado

Cristalización complejo alta muy alta Muy alto

Inclusión en gel intermedio moderada baja variable

Retención en intermedio moderada variable alto

membrana
Enzimas Inmovilizadas

Propiedades deseables en una matriz

Alta área específica.

Alta capacidad de carga.

Elevada resistencia mecánica, química

y biológica, insolubilidad, bajo costo, etc.
Enzimas Inmovilizadas

En general: Deseable disponer de

matrices de estructura
macroporosa, con suficiente
resistencia mecánica para evitar la
disgregación o fractura durante la
operación del bioreactor.
Enzimas Inmovilizadas

Limitaciones para uso industrial:

Mayores costos de elaboración del
biocatalizador.
Moderado rendimiento en la expresión
“a”.
Para el procesamiento de S de alto peso
molecular.
Resistencia de la industria al cambio.
Enzimas Inmovilizadas

Limitaciones de menor relevancia

para aplicaciones de enzimas
inmobilizadas:

En análisis (Biosensores)

Medicina.
Evaluación del proceso de inmovilización:
•Capacidad del soporte a ligar la enzima,
Rendimiento de Inmovilización (RI)
EI EI
RI  
ET EI  ER  EP
•Expresión aficiente de la “a”, Actividad
Específica (AE)
EI
AE 
M
La calidad del catalizador enzimático
producido vinculada a su estabilidad
operacional expresada a través del t1/2
•Para el caso de una cinética de
inactivación simple de primer orden:

ln 2
t1/ 2 
KD
 Efectos de la Inmovilización de enzimas
Afectan su comportamiento cinético

1) Efectos conformacionales
• Relacionados con la alteración de la
estructura de la molécula enzimática.
• Difíciles de evaluar y modelar.
2) Efectos Microambientales
• Efectos de partición.
• Restricciones difusionales.
Cinética intrínseca.
Que se observaría en ausencia de
efectos microambientales.
Cinética inherente.
Que se observaría en ausencia de R.D.
Cinética efectiva o aparente.
Medida “real” con los efectos
microambientales.
RD Externas:
α: (número de Damkheler)
η: (factor de efectividad) : ƒ(α, β0)

RD Internas:
Φ: (módulo de Thiele), β=ƒ(z, Φ)
η: ƒ(α, β0)

Presencia simultánea RDE y RDI.

 : f (i ,  )
 Fig. Esquema de Diseño y Evaluación de Reactores
Enzimáticos

Modelo Cinético
Balance Materia
v = ƒ(E, X)

Restricciones
Modelo Inactivación
Difusionales
E = ƒ(t, T)
η = ƒ(s0, Φ)

Modelo de Comportamiento
K . E(t)
= ƒ(si, X)
F.K
 Reactores Enzimáticos
Por Lotes: STR

Contínuos: FP CSTR
 Diseño Básico de Reactores
Enzimáticos

Acumulación Sustrato que Sustrato que Sustrato que

de S en un = se alimenta al - sale del - reacciona en el
elemento de V elemento de V elemento de V elemento de V
 Reactores Por Lotes

Sustrato que – Acumulación

=
reacciona en V de sustrato
en V
S

vi = _ ds t =_ ds …(1)
dt S0
vi

En términos de conversión X
si . dx
v(e, X) = …(2)
dt
Expresión cinética generalizada en términos de x:

k e1  X 
v
a  bX  cX 2

Donde:

K K si  1 1 1   1 2 
a  1   b  K     si     1
s i K K  K1 K K   K2 K 

 1 1 K 
c  si    
 K K2 K1 K2 
 Reactor Continuo
Reactor Lecho Fijo (FP): balance en un dv

Entrada – Salida = Consumo

F . Si (1 – X) – F . Si(1 – X – dX) = v i dV ; V = VRЄ

F . Si dX = v i dV …(3)
S X V
_ ds dx dV V
= = …(4) ; =
v v(e, X) F . si F
S0 0 0
 Reactor Continuo
Reactor CSTR: operando e.e
Alimentación – Salida = Consumo

F . Si – F . S = v . V …(5) V = VRЄ

En términos de X:

X
= …(6)
v(e, X) Si
Gráficos para ecuaciones de Diseño de Reactores
Enzimáticos Ideales (A): STR, FP (B): CSTR

1
A 1
B
vi vi

S S0 S S0
 Expresiones matemáticas para el
comportamiento de Reactores Enzimáticos
k e  kE 
  
K  F K 
Reactores por Lotes o continuo,
Comportamiento Cinético Reactor Continuo Agitado
Lecho Fijo
si
 a  b  c  ln 1  X  
Generalizado K si

aX  bX 2  cX 3 
 b  c X  0.5cX 2  K 1 X

Simple
X  ln 1  X 
si si X
Michaelis – Menten X 
K K 1 X
Inh. Competitiva  1 1   s  si X si X2
ln 1  X 
si
X
  
 
1 i  X   
por Producto K K K1   K1 
 K 1 X K1 1  X

 1 1   s 
ln 1  X  
si si X
X
  
 
1 i  X  
Inh. No Competitiva K K K1   K1 
 K 1 X
si2  si si2  2
Total por Producto 
2KK 2
 
 K 2 1  X  KK 2 
X

Inhibición Acompetitiva por si2

 X 1  X 
si2 si X
si
X  ln 1  X    X 1  0.5 X  X  
Sustrato K KK " K 1 X KK "
•Las ecuaciones de comportamiento, permiten
obtener el valor de X inicial o max (e.e) para
cualquier combinación e.t (E/F).
•Útil también para el diseño del reactor dado
que:
E
e
VR

•También dados X y si se determinan variables

e, t.
Comparación de los métodos de la isomerización de la glucosa
Parámetro Batch (GIsoluble) Batch (Gl inmovilizado) Continuo (PBR)
Volumen del reactor (m3) 1100 1100 15
Consumo de enzima (Ton) 180 11 2
Actividad, período (h) 30 300 1500
Vida activa, períodos 0.7 2 3
Tiempo de residencia (h) 20 20 0.5
Co2+(Ton) 2 1 0
Mg2+ (Ton) 40 40 7
Temperatura (°C) 65 65 60
pH 6.8 6.8 7.6
Formación del color (A420) 0.7 0.2 < 0.1
Filtración -C-tratamiento
C-tratamiento* Intercambio catiónico
Refinación del producto -C - tratamiento
Intercambio catiónico Intercambio de
Intercambio de aniones aniones
Capital, trabajo y costes
5 5 1
energéticos, £.Ton-1
Coste de la conversión,
500 30 5
£.Ton-1
Todo los procesos comienzan con el jarabe de glucosa DE 97 del 45% (p/p) y produce 10000
toneladas por mes de jarabe de fructosa seca de 42%. Algo de la mejora que se puede considerar
en el rendimiento de PBR es debido al desarrollo substancial de este proceso.
* Tratamiento con carbón activado.
Fuente: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/hfcs.html
Pérdida de la capacidad catalítica
durante la operación del bioreactor.

El estudio del fenómeno de

inactivación térmica del biocatalizador
y la determinación de la T operación
de un bioreactor enzimático son
aspectos de la mayor relevancia.
Modelo de inactivación térmica enzimática,
como un fenómeno de primer orden
monofásico:

E  E
KD *

de
  KD e
dt

 exp  K D  t 
e
e0
Diseño de reactores bajo inactivación
térmica.
De ecuaciones de diseño de reactores
ideales:
Reactores por lotes:
k e0 1  exp(  K D  t )
f ( si , x) 
K  KD

Conocido KD se determina la curva de

operación del bioreactor (X vs t) para e0
Las ecuaciones de comportamiento de
FP y CSTR inicialmente (t=0; E= E0)
permitirán determinar el Xi a la salida de los
reactores.
Luego de un tiempo t, la enzima se habrá
inactivado, de modo que:
E0
ln  KD t
Et
Et: actividad residual x
De ecuaciones de comportamiento, lo
anterior resulta:

RFP

 a  b  cln 1  X   b  cX  0.5cX 

2
K t
 a  b  cln 1  X  b  cX  0.5cX 
i i i
ln 2 D
CSTR

aX  bX  cX 1  X 
2 3
K t
aX  bX  CX 1  X 
i i i
ln 2 3 D
i

Conocido KD se determina la curva

de operación del reactor (X vs t)
para e0
Estrategias de operación y optimización

•La operación de reactores enzimáticos

requiere producto de calidad uniforme (X= cte)

•En bioreactores por lotes:

Esoluble: X: f (E, t)

Einmovilizado: Pérdida de capacidad catabólica.

Necesidad de compensar pérdida:

1º Adición de biocatalizador fresco.

2º Remover catalizador gastado y

reemplazarlo por otro nuevo.

3º Aumentar el tiempo de reacción

(monitoreo automático)
En bioreactores continuos EI.

1º Para X= cte sabiendo E/F: cte. Entonces

mantener F variable (muy utilizado).

2º Reemplazo periódicos de catalizador

(complejo)

3º Perfiles de T para compensar la

inactivación, incrementar la reactividad del
catalizador.
Uso de reactores en paralelo desfasados.
ln 2 d
N  H , ts 
ln R P N

N: nº de reactores en paralelo requeridos.

H: tiempo de uso del catalizador: n.t1/2
RP: % variación en la producción que se
desea.
d: días de uso del biocatalizador.
ts: tiempo de desfase entre cada reactor.
Del modelo de comportamiento de
bioreactores se tiene que:
kE V
 f ( si , x), y F
FK 

Combinando, resulta:
kE
  f ( si , x)
VK
despejando:
VK
  f ( si , x) ......(a)
kE
Productividad en reactores enzimáticos.

Cantidad producto  g 
π
Volumen reactor  tiempo  l  h 

p si  x
π  ......(b)
 

k E si  x
Y (a) en (b) resulta:   ......(c)
K V f ( si , x)
Optimización de la π
de (c) si x= cte.
k Esi x
π ......(d)
K V f(si)

entonces si
dπ
0 Si* óptimo
dsi
que reemplazando en (d) se obtiene π *

óptimo
Por ejemplo RFP, con inhibición No
competitiva por producto, se tiene:

1
2 K k2 ln( 1  x)
si 
*

x
k2: constante inhibición
K: constante afinidad
Desarrollo de la ingeniería de enzimas.

•Catalizar un nuevo producto:

Penicilina G + H2O GAPA + AFA

•Reacción intramolecular
E
Glucosa Fructosa
•Extracción de aceites y colorantes
•Mejorar las características organolépticas de
los alimentos:
Modificar lactosa.