CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA

Michael Tswett - 1906

Separação da clorofila de uma

mistura de pigmentos de planta.
 Carbonato de cálcio em pó

Pequena quantidade de amostra

Éter de petróleo

Bandas separadas e de cores distintas.

 éter de
petróleo
mistura de
pigmentos

CaCO3 pigmentos
separados
 CROMATOGRAFIA

Kroma = cor Graph = escrever

Escrevendo em cores
 CROMATOGRAFIA

Princípio Básico

Separação de misturas por interação

diferencial dos seus componentes entre uma
FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e
uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
 USOS E APLICAÇÕES DA
CROMATOGRAFIA

 Ferramenta analítica para separação de

misturas.

 Combinada com química convencional ou

instrumental – identificar espécies químicas.
 CROMATOGRAFIA

Técnica Planar Em coluna

Fase Líquido Gás Fluido Líquido

supercrítico
Móvel

Fase L S FL L S FL S FL L S FL

Estacionária
L= líquido, S = sólido, FL= fase ligada
 TIPOS DE MECANISMOS

 Depende do tipo de fase estacionária.

 Transferência dos componentes da

fase móvel para a fase estacionária.
ADSORÇÃO

Na superfície das partículas sólidas.

PARTIÇÃO
Entre os líquidos da fase móvel e da fase
estacionária que fica nos poros de um
suporte sólido inerte.

LIGAÇÕES HETEROPOLARES
Com componentes iônicos da fase
estacionária.
 Separação dos Componentes

Velocidade de passagem de um soluto

individual na fase estacionária depende da
partição da molécula entre as duas fases.

Kd = Ce / Cm

Kd = coeficiente de partição
Ce = concentração do soluto na fase estacionária
Cm = concentração do soluto na fase móvel
 Valor de Kd elevado.

O soluto tem maior afinidade com a fase

estacionária.

Maior tempo de retenção.

Distância percorrida por cada soluto
num certo tempo.

Resultado das forças de eluição e

resistência.
  Substâncias que se movimentam
vagarosamente: mais fortemente presas à
fase estacionária.

 Substâncias que se movimentam

rapidamente – gastam uma fração de
tempo menor de tempo na fase
estacionária devido à menor solubilidade
ou afinidade a essa fase.
 RAZÃO DE RETENÇÃO

Indica sua migração em relação à fase móvel.

Velocidade do soluto
R=
Velocidade da fase móvel

Fração de tempo que as moléculas

do soluto gastam na fase móvel em
relação à fase estacionária.
 CROMATOGRAFIA EM PAPEL E
CAMADA DELGADA

Distância percorrida pelo centro da zona do soluto

Rf =
Distância percorrida pela frente do solvente
 CROMATOGRAFIA EM PAPEL

 Técnica simples e econômica de separação dos

componentes de uma mistura.

 Cromatografia líquida-líquida e a
separação ocorre por partição (ou
absorção) do soluto entre os dois líquidos.
  Diferentes solubilidades relativas dos
componentes da amostra na fase móvel
(líquida) e na fase estacionária (líquida).

Componentes menos solúveis têm uma

movimentação mais rápida, enquanto os mais
solúveis serão serão seletivamente retidos
com uma movimentação mais lenta.
 FASE MÓVEL E FASE ESTACIONÁRIA

 A celulose do papel é constituída por 2.000

ou mais unidades de glicose anidra ligadas
por átomos de oxigênio.

 Um líquido polar como a água terá grande

afinidade pelas hidroxilas de cada glicose,
formando pontes de hidrogênio: fica retido e
funciona como fase estacionária.
  Líquidos menos polares (solventes
orgânicos): são repelidos por essa estrutura
e funcionam como fase móvel.

n-pentano, ciloexano, tetracloreto de carbono,

benzeno, tricloroetileno, clorofórmio, éter
etílico, acetato de etila, piridina, amônia,
acetona, etanol, metanol, acetonitrila e água
 VANTAGENS

 Simples e econômica.

 Utiliza pequena quantidade de amostra.

 Boa capacidade de resolução.

 Praticidade.
 TIPOS

 Ascendente.

 Descendente.

 Horizontal (circular).

 Bidimensional.
 CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGADA

 Consiste na separação dos componentes de

uma mistura por migração diferencial sobre
uma camada delgada de adsorvente preso
sobre uma superfície plana.

 Superfície: vidro plano ou alumínio.

 VANTAGENS E DESVANTAGENS

 Fácil execução.
 Rapidez.

 Versatilidade.
 Grande reprodutibilidade.
 Baixo custo.
 Aplicação analítica ou preparativa.
  Mais sensível e necessita de menor
quantidade de amostra; entre 10 a 100 vezes
mais sensível do que a de papel.

 Uso de reagentes de revelação corrosivos.

 Mais cara.

 Mais difícil de tirar as manchas da placa

para análise.

 Menor uniformidade para fazer a camada

delgada.
 Processo de Separação

 Adsorção: o soluto é separado entre uma

fase estacionária sólida e uma fase
estacionária móvel líquida.
 PROCEDIMENTO

 A amostra é dissolvida em um solvente

adequado, então, uma certa alíquota desta
solução é aplicada na região de partida e o
conjunto é seco.

 A placa de TLC é então colocada em uma

câmara de desenvolvimento ou cuba, o qual
contém o solvente.
 PROCEDIMENTO

 Inicia-se o que chamamos de

desenvolvimento cromatográfico onde os
componentes da amostra são influenciados
pela ação de duas forças, opostas entre si.

 Capilaridade: é a responsável pelo avanço do

solvente ou fase móvel sobre a fase
estacionária que contém a amostra.
 PROCEDIMENTO

 Interação: tão logo se inicia a migração da

fase móvel, a amostra é dissolvida e começa a
ser arrastada pela fase móvel. Neste
momento aparecem forças de interação
entre os componentes da amostra e a fase
estacionária. Estas forças de interação se
opõem à força de arraste da fase móvel
(capilaridade) retardando o avanço dos
componentes da amostra.
Forma incorreta Forma correta de
de aplicação aplicação
As três formas de aplicação resultam em boas
condições de separação, dependendo da fase
móvel escolhida.
 Zona de aplicação - tão pequena quanto possível.

 Hexano - o ponto de aplicação ficou o menor possível.

 O ideal é evitar o efeito de anel, como

ocorreu com a água.
CROMATOGRAFIA EM COLUNA

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA-SÓLIDA

A fase estacionária é um sólido de

superfície ativa, que pode ser: sílica-gel,
alumina ou celulose.
  O sólido é empacotado dentro da
coluna de vidro e a fse móvel, que é um
solvente composto de um ou mais líquidos
orgânicos, vai eluir os componentes da
mistura através da coluna.
 CROMATOGRAFIA GASOSA

 Ë um dos procedimentos mais utilizados

nos laboratórios modernos.

 Excelente sensibilidade.

 É capaz de separar e detectar

centenas de compostos simultaneamente.
 Vantagens

 Rapidez.

 Alto poder de separação e resolução.

 Alta sensibilidade – 10-12 g.

 Trabalha com pequenas quantidades de amostra.

 Desvantagens

 Analisa somente componentes voláteis.

 A preparação da amostra pode ser

trabalhosa.

 Não é uma técnica qualitativa eficiente –

resultado não conclusivo.
 INSTRUMENTAÇÃO

Gás de Arraste

Fase Móvel em CG: NÃO interage com a

amostra - apenas a carrega através da
coluna. Assim é usualmente referida como
GÁS DE ARRASTE.
 REQUISITOS

INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase

estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO - Deve ser isento de impurezas que

possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FE

H2O, O2 icompatíveis com DCE

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

 CUSTO - Gases de altíssima pureza podem
ser muito caros.

CUSTO A = 99,995 % (4.5)

C
B = 99,999 % (5.0)
B
A C = 99,9999 % (6.0)
PUREZA

COMPATÍVEL COM DETECTOR - Cada

detector demanda um gás de arraste específico
para melhor funcionamento.
 Injetor “on-column” Convencional
1

4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatográfica
 Injeção “on-column” de líquidos

1 2 3

1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.
3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela
coluna.
 Parâmetros de Injeção

TEMPERATURA DO INJETOR - Deve ser

suficientemente elevada para que a amostra
vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da

temperatura de ebulição do componente
menos volátil.
 Parâmetros de Injeção

VOLUME INJETADO - Depende do tipo

de coluna e do estado físico da amostra.
Amostras Amostras
COLUNA Líquidas Gasosas

empacotada 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL

 = 3,2 mm (1/4”)

capilar 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL

 = 0,25 mm

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um

solvente adequado e injeta-se a solução.
 Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de
misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE
EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente
estáveis.
 1 6
2 Observação:
em vermelho:
temperatura
controlada
4

5
3
1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
 Microseringas para Injeção
Microseringa de 10 
L:
êmbolo agulha (inox
316)

corpo
(pirex)

Microseringa de 1  L (seção ampliada):

corpo agulha

guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
Colunas: Definições Básicas
 EMPACOTADA CAPILAR
 = 3 a 6 mm  = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Recheada com sólido pul- Paredes internas
verizado (FE sólida ou FE recober-tas com um
líquida depositada sobre filme fino (fra-ção de 
as partículas do recheio) m) de FE líquida ou
sólida
 Temperatura da Coluna
Estrutura química
do analito
p0 = f
Temperatura
da coluna

Temperatura Pressão Velocidade

da de de
coluna vapor migração

ANALITO ELUI MAIS

RAPIDA-MENTE (MENOR
RETENÇÃO)
 TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE
CONFIÁVEL DA
TEMPERATURA
DA COLUNA É
ESSENCIAL
PARA OBTER
BOA
SEPARAÇÃO EM
CG
Eficiência de Sistemas Cromatográficos

A migração um analito
pela coluna provoca
inevitavelmente o
alargamento da sua
banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separação deficiente de Picos mais largos e
analitos com retenções menos intensos = menor
próximas. detectabilidade

EFICIÊNCIA - Capacidade de eluição com o

mínimo de dispersão do analito.
 FASES ESTACIONÁRIAS

LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos

porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de
materiais inertes (colunas capilares)

FE
líquida

SUPORTE
Sólido Tubo capilar
inerte de material
poroso inerte
 FASES ESTACIONÁRIAS

Para minimizar a perda de FE

líquida por volatilização,
normalmente ela é:

Entrecruzada: as Quimicamente ligadas:

cadeias poliméricas as cadeias poliméricas
são quimicamente são “presas” ao suporte
ligadas entre si por ligações químicas
Fatty Acids in Potato Chips
Fatty Acids, C2-C7
Aroma Volatiles
from Stored Apples
Sterols in Olive Oil
Sterols in Olive Oil
Distilled Lime Oil
 Orange Oil

5% SP-2100/0.1% SP-401 on 100/120 SUPELCOPORT

75°C (2 min) to 175°C at 4°C/min
nitrogen, 20mL/min
FID , 0.2µL