Prinsip, cara kerja, QC dan

interpretasi Realtime PCR

Wasista Hanung Pujangga
• Real time polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu metode
analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time PCR adalah
suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi
(memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target
molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
Prinsip kerja Real-Time PCR
• Real Time PCR dapat dikatakan sebagai mengoleksi danmenganalisa
data yang terjadi selamaproses reaksi.
• Real Time PCR berarti amplifikasi dan Analisa terjadi bersamaan
• Dikenal sebagai Rapid Cycle PCR dengan siklus tempertur antara20-60
detik
• ProdukPCR dapat dianalisa selama proses amplifikasi
• Menggunakan pewarna DNA dan probe fluoresensi
• Data dikoleksi dari tabung yang sama didalam instrument yang sama
• Tidak ada transfer sampel, penambahan reagensia atau gel separasi
Aplikasi realtime PCR
Aplikasi dari Real Time PCR (Biosoft, 2007) antara lain digunakan sebagai:

• Studi expresi gen secara kuantitatif

• Penghitungan jumlah copy DNA (cDNA) pada genom atau DNAs virus
• Analisis pembedaan alel atau genotiping Single Nucleotide Polymorphism
SNP
• Untuk verifikasi hasil microarray
• Keefektifan obat terapi
• Penghitungan kerusakan DNA.
Aplikasi PCR di Bidang Riset / Penelitian
Aplikasi realtime PCR
Riset / Penelitian Penyakit Infeksi -Contoh

• HIV RNA –genotyping

• HBV DNA -cccDNA • Dengue
• HCV RNA –micro RNA • Salmonella thyposa
• MTB DNA • Enterovirus
• CMV DNA • Rotavirus
• HPV DNA –genotipe16 & 18 • H5N1
• Herpes Virus • H1N1
• Toxoplasmosis • Legionella
• Fecal Microbiota • Polio Virus
• Sepsis (gram +/ garm-/ Candida) • Helicobacter pylori
• EBV • Dll.
Perbedaan cara kerja PCR & Realtime PCR
PCR & Realtime PCR
Apakah Real-Time PCR ?
Format deteksi :
• SYBR Green I
• Hybridization Probes (HybProbe Probes)
• Hydrolysis probes / Taqman Probes
• Simple Probe Probes
• Dapat melakukan ‘real-time quantitative PCR’
• Real Time PCR’adalah metode yang ‘powerful’, sederhana dan cepat
Format SYBR Green I
• Ketika SYBR Green I berikatan dengan primer dsDNA, akan terjadi
peningkatan fluoresensi
• Selama tahapan PCR yang berbeda, intensitas dari sinyal fluoresensi
akan berbeda, tergantung darijumlah dsDNA yang ada.
Format Hybridization Probe / HybProbe
• Hybridization probe merubah fluoresensi pada saat hibridisasi
dengan‘fluoresceneresonance energy transfer (FRET)’
• 2 probe oligonukleotida sekuen spesifik dilabel dengan pewarna yang
berbeda (donor & aseptor) dan ditambahkan kedalam ‘master mix’
• Dalam Analisa HybPro beadanya produk amplifikasi spesifik dapat dibaca
secara kuantitatif berdasarkan peningkatan fluoresensi Fluorescein
Format Hybridization Probe / HybProbe

• Spesifik karena 2 probe dihibridisasi dengan target dengan cara yang

sangat sekuen spesifik
• Primer-dimer tidak terdeteksi karena probe sekuen spesifik tidak
mengenalinya
• Dapat untuk aplikasi deteksi mutasi, analisis SNP, genotyping SNP ,
qPCR dan multiplex tes
Format Hydrolysis Probes

• Dikenal juga dengan nama‘Taqman Probe’

• Menggunakan aktivitas exonuclease5’ dari DNA Polymerase
• Sebuah probe terdir idari2 label, fluorescence reporter dan fluorescen
equencher, yang sangat dekat satu sama lain. Ketika probe masih
utuh, quencher menahan sinyal fluoresensi reporter
• Pada proses extention, aktivitas exonuclease5’ dariDNA Pol
memotong hidrolisis probe dan memisahkan reporter dan quencher
• Sinyal fluoresensi reporter tidak lagi tertahan dan dapat memancarka
nsinyal fluoresensi
• Peningkatan sinyal fluoresens idari reporter berbanding langsung
dengan akumulas iproduk PCR
Format Simple Probes

• Simple Probe adalah bentuk sederhana dari hybridization probe dan

hanya menggunakan1 probe saja
• Ketika terjadi hibridisasi akan memancarkan sinyal fluoresensi yang
lebih besar
• Perubahan sinyal fluoresensi tergantung dari status hibridasi dari
probe, semakin stabil hibridisasinya semakin tinggi temperature
melting
• Untuk aplikasiS NP genotyping dan deteksi mutasi
Laboratory Set-up
Cara Kerja Realtime PCR
Cara Kerja Realtime PCR
• RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan
sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA.

• RT-PCR meliputi tiga tahap utama.

- Tahap pertama  reverse transcription  RNA ditranskrip balik menjadi
cDNA  enzim reverse transcriptase dan primer.
- Tahap kedua  denaturasi dsDNA at 95°C.
- Tahap ketiga  Amplifikasi PCR  dilakukannya perpanjangan DNA
menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang
termostabil, biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk
aktivitas enzim polymerase.
QUALITY CONTROL

• Kit Controls
Kontrol Positif
• Menunjukkan bahwa semua reagensia dan alat berfungsi baik, semua tahap
sudah sesua iprosedur

Kontrol Negatif
• Menunjukkan bahwa reagensia tidak terkontaminasi atau tidak ada malfungsi alat
yang menyebabkan hasil positif

Kedua control harus dijalankan dalam setiap pemeriksaan

KontrolInternal
• Menunjukkan bahwa tidak ada inhibisi PCR atau tidak ada malfungsi alat pada
hasil sampel yang negatif
Interpretasi Realtime PCR
Contoh
Limit deteksi untuk subtipe H5
(Matrix gene-specific TaqMan assay) :
• Ct < 36 = positif
• Ct 36 – 40 ambiguous, perlu diulang
atau diteliti lebih lanjut
• Ct > 40 = negatif
Terimakasih