Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Ingeniería de Productos Biológicos

“Protocolo para la producción de anticuerpos contra

Salmonella typhi”

Profesoras:
Equipo 3 Biofarmas
-Chávez Infante Verónica
-Altamirano Reyna Frida Selene -Moreno Guerrero Karen Gisela
-Hernández Olvera Stephanie B.
- Ibáñez González Luis Enrique Grupo: 8FV2
-Lara Villamar Mariana
Objetivo

GENERAL
 Elaborar un protocolo de inmunización con el fin de producir anticuerpos contra
Salmonella typhi

ESPECÍFICOS
 Ensayar las técnicas de inmunización con los conejos, practicando algunos de los
esquemas de inmunización ya establecidos.
 Obtener un suero inmune mediante la inoculación de conejos con Salmonella typhi
y comprobar su poder aglutinante poniéndolo en contacto con su antígeno
homologo.
 Introducción

 La inmunización, es el proceso mediante el cual un individuo se expone a un antígeno por

primera vez, y éste induce una respuesta protectora contra una patología determinada
por ese mismo antígeno. Su objetivo es la prevención de enfermedades (Telijón, 2006).

 Los términos "antisuero" o "suero inmune" son utilizados

comúnmente para referirse a un suero que contiene altas
concentraciones de anticuerpos contra un antígeno dado,
obtenido generalmente mediante un proceso de inmunización. Los
anticuerpos (Acs) pueden ser considerados como herramientas
biológicas de gran utilidad para la detección y caracterización de
diversas moléculas de interés diagnóstico o investigativo, gracias a
su especificidad, la cual es explotada de muchas maneras en las
técnicas inmunoquímicas.
El éxito en la generación de antisueros con un alto título de anticuerpos deseado
dependerá de:
 La naturaleza del antígeno (proteíco, polisacárido o lipídico)
 Tamaño e inmunogenicidad (Ag)
 Vía de administración elegida (que permita la dosificación lenta de la sustancia o bien
el contacto directo con tejidos linfoides que permitan un adecuado reconocimiento
del antígeno)
 Calendario que aproveche las respuestas inmunitarias primarias y secundarias que se
generan ante la presencia del antígeno .

(Lamonte, B., 2007)

 Antígeno Anticuerpo
 Es una sustancia que al  Glicoproteínas capaces de una
introducirse en un organismo combinación especifica con el
vertebrado induce a una antígeno que ha causado su
respuesta inmune, tanto humoral producción en un animal
como celular. susceptible.
 Genera la producción de  Son producidos en respuesta a la
anticuerpos y la especificidad invasión de moléculas foráneas
para reaccionar contra ellos. en el cuerpo como parte de la
inmunidad adaptativa.
 Particulados y solubles.
6 Salmonella typhi
 Es un agente causal de infecciones
intestinales, conocidas como
salmonelosis.

 La fiebre entérica, que incluye la fiebre

• Bacilos gruesos cortos.
tifoidea causada por S. typhi, y la fiebre
• Es gramnegativo
paratifoidea que es patológica y
• Anaerobio Facultativo.
clínicamente similar a la tifoidea pero con
• Agrupamiento celular aislado en pares o
síntomas menos fuertes, causada por S.
cadenas cortas.
paratyphi A, B, o C.
• Su tamaño es de 0.6 a 0.7 micras de grosor y
2 a 3 micras de largo.
• Habita en heces, agua y alimentos
contaminados
• Sólo infecta a la especie humana y se aloja en
el intestino delgado, principalmente.
 Fuentes de transmisión

 Prevalece en animales comestibles y

también en mascotas.
 Las personas contraen la salmonelosis
a través del consumo de alimentos
contaminados de origen animal
(principalmente huevos, carne, aves
de corral y leche)
 También pueden transmitirse entre las
personas por vía fecal-oral
 Estructura de Salmonella typhi

 El género Salmonella tiene una estructura antigénica similar al resto de

enterobacterias, con tres tipos de antígenos:
Antígeno somático (O)
Antígeno flagelar (H) o (d)
Antígeno capsular o de envoltura (Vi) o (K) (específico para Salmonella typhi, dublin, y
paratyphi C)
 Prueba serológica de diagnóstico
 Son baratas y rápidas, pero en países desarrollados son cada vez menos utilizadas por su
poco valor diagnóstico.
 Responde produciendo anticuerpos aglutinantes.
 El informe del resultado de la prueba se hace tomando en consideración la dilución más
alta que se observe en la reacción positiva.
Desarrollo Experimental
 Protocolo de inmunización con Salmonella typhi
Inocular con A 20 mL de caldo
Salmonella typhi en un nutritivo con centrifugar a 3500
Obtención del
matraz con caldo Salmonella typhi rpm durante 13
antígeno
nutritivo e incubar a agregar 0.5 mL de minutos.
37°C durante 24h. formaldehido.

Desechar el sobrenadante
y resuspender el sedimento
bacteriano en solución
salina con el objeto de fijar
químicamente los
componentes
microbianos.
Centrifugar 3 veces Inocular 1 ml del
Igualar turbidez con la
más a 3000 rpm medio en tubos con
de un tubo del
durante 15 minutos, y caldo tioglicolato e
nefelómetro de
lavar con solución incubandolos a 37°C
McFarland.
salina. durante 24 horas.

Mantener la
suspensión en
refrigeración hasta su
uso.
 Obtención del suero preinmune
Sangrado de oreja del conejo

Localizar la Limpiar con

Aplicar Sangrar al
arteria central una torunda
xylocaina conejo (3ml)
de la oreja con alcohol

Decantar Pasar
Centrifugar sangre a
Guardar en suero en
3000 rpm tubo
congelación tubo
15 min vacutainer
eppendorf
Realización de la inmunización del conejo
 Protocolo de inmunización
ANTÍGENOS BACTERIANOS PARTICULADOS
Inyección Tiempo Fecha Volumen Vía Notas
No. (días)
1 0 10/11/2017 0.50 mL IV la coneja se
encontraba
dócil
2 4 14/11/2017 0.75 mL IV -

3 7 17/11/2017 1.00 mL IV -

4 11 21/11/2017 1.25 mL IV la coneja

estaba muy
inquieta y fue
complicado la
administración
del antígeno.
Sangrado 17 27/11/2017 fue
complicado
 Obtención del suero inmune

Extraer 3ml de Pasar a un centrifugad Decantar

sangre de la tubo a a 3000 suero en tubo
vena central vacutainer rpm/5 min eppendorf
de la oreja
 Precipitación capilar
Los tubos capilares fueoron
Se realizaron diluciones del
divididos en tres partes
antígeno, utilizando solución
iguales utilizando un
salina.
marcador indeleble.
Para los demás capilares se
realizó el mismo
procedimiento, utilizando las
diluciones del antígeno y
suero inmune, el último tubo
utilizó antígeno completo y
suero inmune.
El primer tubo capilar fue
llenado consuero preinmune
hasta la primera
marca,después fue invertido
para que el antisuero bajara
al extremo contrario.
Se agregó un volumen del
antígeno sin diluir hasta la
segunda marca, se mezcló y
se tapó el capilar con
plastilina.
 Técnica de difusión en placa de Oüchterlony
20 mL de
solución de
agarosa al 0.3% En una placa Petri Colocar molde
vaciar primero 10 Dejar para obtener los
Preparar
ml de gel de pozos donde se
agarosa al 0.3%
solidificar
20 mL de colocara el suero
solución de
agarosa al 0.5%

Llenar con el
antisuero el pozo Remover los
Agregar 10 ml
central y con el moldes y el gel Dejar
antígeno diluido los de agarosa al
del interior de las solidificar 0.5%
pozos periféricos perforaciones

Repetir
Etiquetar y guardar
procedimiento
con una muestra
en refrigeración
diferente durante 48 horas.
Resultados
 Prueba de identificación
A Tinción Gram

A B

Figura 2. Tinción Gram de la muestra

original que contenia a S. typhi (A) y
Figura 1. inoculación de S. typhi en agar nutritivo. A) tinción gram apartir de la muestra
control negativo, B) S. typhi inactiva, C) S. typhi tomada del cultivo en el cual se
activa (la muestra proviene del cultivo madre). inoculo el m.o inactivo (B).
 Prueba de esterilidad

La inactivación de S. typhi se comprobó

añadiendo 1 mL del antígeno en 9 mL de medio
fluido de tioglicolato
Precipitación capilar

Figura 3. Técnica de precipitación capilar

 Técnica de difusión en placa de Oüchterlony

A B

Figura 4. Técnica de difusión en agarosa A)muestras de S. typhi, B) inmunodifusión de

albumina (muestra externa).
Análisis de resultados
Al inicio de la práctica se realizo la identificación del antígeno elegido, es importante
demostrar que efectivamente se tiene la presencia del antígeno a utilizar, se identifico el
antígeno mediante la observación de una tinción Gram en el microscopio, y se comprobó
que efectivamente se trataba del Ag en estudio.

Figura 5. Tinción Gram de S.

typhi.
Figura 6. Tinción Gram de la muestra de S. Typhi
 Método de difusión en placa de Ouchterlony.

 Por medio de la inmunodifusión doble de Ouchterlony

se pueden realizar análisis cualitativos y cuantitativos
de antígenos y anticuerpos en una solución,
mediante una inmunoprecipitación en gel de
agarosa. Cuando en una caja de Petri con agar se
colocan distintas soluciones de antígeno y anticuerpo
y se les dejan difundir libremente, en la región donde
las concentraciones de difusión se encuentran
proporciones de equivalencia se forma un
precipitado que se visualiza como una banda opaca
en el agar. (Bautista, 2005).

Figura 7. Técnica de Ouchterlony

 • Es una prueba que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo.
• Se colocan en pocillos separados en antígeno y el anticuerpo, los cuales
difunden a través de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables,
creando un patrón de precipitado.
• Los tres principales patrones son el de identidad, no identidad e identidad
parcial

Primer patrón de
identidad El tercer patrón de identidad
Se presenta cuando parcial
los antígenos Se presenta cuando existen
comparten todos los determinantes en común
determinantes por lo tanto los antígenos
antigénicos están emparentados este
patrón.

Segundo patrón de no
identidad
Se representa cuando ningún
determinante es compartido.
 Sin embargo, no se obtuvieron resultados en esta prueba realizada ya que
los pozos no se formaron de la manera adecuada y el suero no difundió.
 Precipitación capilar

 La mezcla de antígeno soluble y su inmunosuero en

un capilar da lugar a un precipitado visible
únicamente si la proporción de antígeno-
anticuerpo es adecuada.
 Esta técnica permite identificar antígenos
disponiendo de los antisueros correspondientes, se
realiza en capilares o tubos, se deposita en el
fondo el antisuero y se deja resbalar por la pared
una dilución adecuada del antígeno que se sitúa
sobre aquel. Figura 8. Reacción positiva al
 Junto a la interface de ambos líquidos se produce método de inmunoprecipitación
un anillo de precipitación blanquecino si el
anticuerpo y el antígeno son homólogos (Bautista,
2005)
 Precipitación capilar

 Después de efectuar la producción de anticuerpos utilizando como antígeno

S. typhi, se realizó la extracción del antisuero.
 Una vez obtenido el antisuero se realizó la prueba de precipitación en
capilar.
 En la realización de esta prueba se coloca el antígeno y el antisuero en un
capilar, se utilizan 10 capilares para el desarrollo de esta prueba, se tiene una
mayor concentración del antígeno en los primeros tubos, y conforme
avanzan se tiene una concentración menor de antígeno.
 No se obtuvo formación de precipitado debido a que las diluciones
realizadas estaban muy diluidas.
 En la zona donde existe más antígeno que anticuerpo, los complejos formados son
solubles, por lo que no hay precipitación.
 En donde existe una mayor cantidad de anticuerpos y una menor cantidad de
antígeno, los complejos formados son solubles, por lo tanto no hay precipitación
 Cuando existe una cantidad igual de anticuerpos y antígenos se forman complejos
grandes que no son solubles y son visibles, a esta zona se le denomina zona de
equivalencia.

Figura 9. Prueba de inmunoprecipitación en capilares.

 Se esperaba obtener una mayor producción de anticuerpos sin embargo el
protocolo propuesto no fue el adecuado, debido a que no se consideró que la dosis
adecuada con base en el peso del conejo
 Teóricamente se esperaba obtener producción de anticuerpo IgG, debido a que es
el que se produce en mayor concentración con respecto al anticuerpo IgM como se
observa.

Figura 10. Producción de anticuerpos.

 Conclusiones

 No fue posible comprobar la presencia de anticuerpos contra Salmonella

typhi.
 La concentración de lipoproteínas que se administró al conejo pudo ser
baja.
 Es recomendable estandarizar la concentración del antígeno para mejorar
la obtención de resultados fiables en los ensayos de inmunoprecipitación.
 Para tener una mayor confiabilidad también es recomendable cuantificar
y estandarizar la concentración de los anticuerpos.
 Referencias
1. Calva, E. Salmonella typhi y la fiebre tifoidea: de la biología molecular a la salud
pública. UNAM. Consultado 11/Octubre/17 De:
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap4/
2. Immunization to Vi and O Antigens of Salmonella typhi Using a Stable Antigen in Oil
Author(s): David C. Y. Chu, Robert E. Hoyt and M. J. Pickett Source: The Journal of
Hygiene , Vol. 54, No. 4 (Dec., 1956), pp. 592-596 Published by: Cambridge University
Press Stable URL: http://www.jstor.org/stable/3860783 Accessed: 13-08-2016 00:50
UTC
3. Lomonte, Bruno (2007). Manual de Métodos Inmunológicos. Facultad de
Microbiología, Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica. Costa Rica.
4. C. C. Ibebuike (2008).Production of high polyvalent antisera against Salmonella.
Scientific Research and Essay Vol. 3 (5), pp.204-208, May, 2008. Academic Journals.
Available online at http://www.academicjournals.org/SRE ISSN 1992-2248 © 2008.