Seminario 2017

Bignert, Marianela
Longhi, Sara
 Introducción
• En el presente artículo se evaluaron los efectos de la actividad enzimática sobre la calidad
aromática del vino durante el proceso de fermentación, usando diferentes estrategias de co-
inoculación de levaduras Saccharomyces y No-Saccharomyces.
• Se ensayaron 3 cepas de levaduras autóctonas en cultivos puros y mixtos:
BSc562 (Saccharomyces cerevisiae)
 Cultivos puros BDv566 (Debaryomyces vanrijiae)
BCs403 (Candida sake)

MSD1 (1% Saccharomyces c.- 99% Debaryomyces v.)

 Cultivos mixtos MSD2 (10% Saccharomyces c.- 90% Debaryomyces v.)
MSC1 (1% Saccharomyces c.- 99% Candida s.)
MSC2 (10% Saccharomyces c.- 90% Candida s.)

• Se ha demostrado mediante diferentes estudios sobre el crecimiento e interacciones entre

levaduras en cultivos mixtos, que su impacto en el sabor, perfil aromático y calidad final,
dependen de:
• Las cepas
• Las estrategias de inoculación
 Materiales y Métodos
 Microorganismos y medios:

Cepas aisladas de mosto en diferentes etapas de fermentación

Propagación
Determinación de la biomasa total YEPD
Mantenimiento

 Mosto:
Tratamiento para eliminar la microbiota natural

 Fermentaciones:
Microvinificaciones de 3 L a 20°C a las cuales fueron inoculadas con los cultivos
puros y mixtos.
Como control negativo se utilizo el mosto sin inocular.

 Variables enológicas:
Fermentación controlada por perdida de peso
Azucares reductores DNS
 Determinaciones enzimáticas:
“U”= unidad de actividad enzimática, cantidad de enzima que liberó 1 µmol de
producto/ tiempo.
La actividad enzimática se expresa como como unidades enzimáticas por gramo de
peso seco (en 1 mal de muestras ensayadas) U/g DW.
Para estimar la producción total de enzima se calculo el área bajo la curva (AUEC)

 Cromatografía de gases y cromatografía de gases-espectrometría de masa de

volátiles
Análisis Cualitativo: para la identificación de compuestos volátiles se comparo los
tiempos de retención.
Análisis Cuantitativo: usando las áreas relativas relacionadas con el estándar
interno, se relaciono cuanto se absorbió.

 Análisis estadístico:
Se utilizo ANOVA unidireccional
Se utilizo estadística multivariable para asociar dos grupos, actividad enzimática y
grupo de aromas, relacionándolas con los cultivos inoculados.
 Actividades enzimáticas durante la fermentación:
Método: Cluster Analysis

MSC2 puede ser separado del resto.

 Se relaciona compuestos aromáticos
con producción enzimática
-La producción de ésteres y ac. Por levaduras
mostró una correlación positiva de proteasas
y β-glucosidasas, pero negativa para
Norisoprenoides y cetonas
-Se evidenció una correlación entre
pectinasas, amilasas y xilanasas y 2 grupos de
compuestos aromáticos: terpenos y alcoholes

Se correlacionan los cultivos mixtos

con los compuestos aromáticos MSD1 MSC2

-Clara separación de las 4 fermentaciones mixtas Cetona y Norisoprenoides_ Ésteres: Floral,

-MSC1 y MSC2 muestran una fuerte correlación con la flores y frutas tropicales Frutal
producción de β-glucosidasas y proteasas en relación
al contenido de ésteres y ácido grasos. MSD2 MSC1
-MSD1 y MSD2 asociadas con actividad: xilonítica,
Ác. Grasos:
pectinolítica, amilolítica y con los compuestos: Terpenos: varietal,
queso, rancio
rosa
alcoholes, terpenos, cetona y norisoprenoides.
 Discusión
• Se decide calcular AUEC (Area Under the Enzime Curve) porque
representa adecuadamente el comportamiento de la actividad
enzimática durante el proceso de fermentación.
• No hay relación directa entre actividad enzimática y biomasa
detectada. (población de No-Saccharomyces, actividad
enzimática, concentración de etanol)
• El aroma es uno de los principales contribuyentes enzimáticos
microbiológicos del vino.
• Durante las fermentaciones, las levaduras liberaron enzimas que
produjeron metabolitos secundarios tales como: ésteres,
alcoholes superiores, ácido graso, terpeno, C13-norisoprenoides.
• El tamaño de población y el tiempo de supervivencia de las
levaduras No-Saccharomyces en el medio fermentativo puede
afectar las cualidades del vino
 Discusión

• Acetatos ésteres
• Resultado de la reacción de Acetil CoA y los alcoholes superiores.
• Se forman durante la degradación de aminoácidos o carbohidratos
• Por lo anterior, se explica la correlación positiva entre estos compuestos y las
carbohidrolasas y proteasas.
• Las levaduras No-Saccharomyces estudiadas secretan un alta concentración
de carbohidrolasas y consecuentemente, los cultivos mixtos de las mismas
pueden contribuir a vinos con altos niveles de acetato ésteres (ver MSC1)
Swiegers y Pretorius 2017
• Son producidos principalmente por el metabolismo de la levadura Saccharomyces
cerevisiae (a través del metabolismo de lípidos y Acetil CoA)
• También existen varias levaduras no Saccharomyces que contribuyen al aroma de
ésteres en el vino; tales como Hanseniaspora guilliermondii, Pichia anomala
• Alcoholes Superiores:
• Correlacionaron negativamente a la actividad enzimática.
• Son compuestos que se asocian con compuestos que se forman durante las etapas pre-
fermentativas (cosecha, transporte, molienda)
• El principal alcohol superior es 2 feniletanol (rosa, miel) puede originarse de su forma
glicosidada presente en la uva, más que por la fermentación alcohólica.
• Actividades β-glucosidasas y carbohidrolasas pueden involucrarse en la descomposición
de precursores no aromáticos con la subsecuente liberación de alcoholes superiores.
Ribéreau-Gayon, 2003
Formación de los alcoholes superiores por la levadura:
-Reacción de Ehrlich (catabolismo de los aminoácidos)
-Síntesis vía ácidos cetónicos
correspondientes, originados
en el metabolismo de los azúcares.
Ej: propan 1-ol, no le corresponde ningún
aminoácido, sino que proviene del
α ceto butirato que se forma del piruvato
y de la acetil CoA.

La función de la producción de alcoholes

en la levadura no se sabe si es:
-un simple gasto de azúcar de un proceso de destoxificación del medio intracelular
-medio de regulación del metabolismo de los aminoácidos.
Swiegers y Pretorius 2017
-Las levaduras No-Saccharomyces también pueden contribuir a los niveles de alcoholes superiores (Inóculo mixto
Saccharomyces cerevisiae y Picchia fermentaris produjeron 1-propanol, n-butanol, 1-hexenol.
 Discusión
• Ácidos grasos:
• Existe una correlación positiva entre la actividad enzimática y el ácido n-
decanoico
• Su presencia puede ser el resultado de alteraciones en la composición del
mosto, luego de la acción de carbohidrolasas que afectan el metabolismo
de las levaduras.
• Juegan un rol muy importante en el balance del flavor del vino, ya que
presente en el mosto prevé parcialmente la hidrólisis de los etil ésteres.
• Terpenos
• Está presente en el mosto del vino, enmascarado como no volatil.
• Llegan a ser agliconas libres a través de la acción de las de β-glucosidasas
y carbohidrolasas durante la fermentación.
• C13-Norisoprenoides
• A pesar de los altos niveles en MSD1, el análisis reveló correlaciones
negativas significativas con la actividad enzimática.
• Lo anterior, puede explicarse ya que los mismos pueden formarse por
reacciones no enzimáticas como la degradación de carotenoides.
 Conclusiones
• Inóculos mixtos de Saccharomyces y No-Saccharomyces
afectaron el perfil aromático del vino
• Diferentes compuestos aromáticos fueron positiva y
negativamente asociados con la actividad enzimática de las
levaduras y cada condición mixta presentó un perfil
aromático particular.
• Este estudio contribuyó a un mejor entendimiento del efecto
de la actividad enzimática de levaduras sobre la
transformación de compuestos que ocurren durante la
fermentación del vino y tiende a incrementar la
comprensión de las interacciones microbiológicas en este
complejo ambiente.