Variables Pre -

analíticas en el
Laboratorio de
Hemostasia
Objetivos de la ponencia

 Identificar una muestra de sangre apropiada para la

evaluación de la hemostasia
1ra causa de muerte en el mundo

 1/3 de las muertes serán

por eventos trombóticos
 Los sobrevivientes
reciben terapia
anticoagulante
 El laboratorio de
hemostasia es de vital
importancia en la
prevención e
identificación de una
trombosis potencial
 Perspectivas

 Se conceptua que la hemostasia solo tiene que

ver con “coagulación”
 La hemostasia es mucho más compleja que la
solo coagulación; e incorpora varios elementos
no relacionados con los procesos de
coagulación
 La mayoría de laboratorios de hemostasia realiza las pruebas globales de
coagulación :
 Tiempo de protrombina ( TP/INR )
 Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa)
 Tiempo de Trombina ( TT )
 Dosaje de fibrinógeno
 Dimero – D
 Estas pruebas se realizan en pacientes bajo sospecha de una potencial
disfunción en la hemostasia secundaria, congénita (ej: hemofilía) o
adquirida (ej: CID)
 Problemas pre-analíticos pueden aparecer en cualquier punto antes del
proceso de la muestra : toma de muestra, manejo, transporte, proceso y
almacenamiento
 Los clínicos son los menos concientes de las variables pre-analíticas del
laboratorio y podrían basar sus acciones clínicas en base a resultados
recibidos, reflejen o no un valor real
Principio de variables pre – analíticas

Categoria Variables
Toma de Muestra Identificación del paciente y
etiquetado
Técnica de toma de muestra
Volumen de la muestra
Tubo de colecta

Manejo de Muestra Almacenamiento

Agitación, centrifugación
Condiciones de Transporte
Demora en el transporte al
laboratorio para su proceso
Paciente Variables fisiológicas
Estados Patológicos
Por estas razones
existen guías para
colección y manejo
de muestras que
deben ser
estrictamente
acatadas y evitar
todo desvío de sus
recomendaciones,
para disminuir el
impacto negativo en
las pruebas de
coagulación
Toma de muestra, proceso y
almacenamiento
 Identificación positiva del paciente
 Considerar pacientes ambulatorios
( homonimias )
 Pacientes hospitalizados : estos deben
seguir estrictas reglas institucionales de
calidad, como el uso de código de barras
o registros electrónicos
 Puede ser usado también otros datos
como: fecha de nacimiento, número de
seguro, fecha de extracción
 El tubo debe ser mezclado por inversión al menos de 3 – 6 veces.
 No mezclar vigorosamente porque puede causar hemólisis o
activación espuria de factores de la coagulación, resultando en un
falso acortamiento de los tiempos de coagulación, y aún una
posible falsa elevación de actividad de factor coagulante
 Algunas muestras para hemostasia no requieren de plasma sino de
suero, como por ejemplo, los anticuerpos anticardiolipina, entre
otros.
 Otro punto son las toma de muestra dificultosas o las tomas de vía
central venosa (requieren un proceso), muestras parcialmente
coaguladas, hemolizadas o muestras activadas, o muestras
diluidas por salina o contaminadas con heparina
 El tipo y medida de la aguja también puede interferir, no menor
de 16 y no mayor de 25, tampoco agujas heparinizadas
 El tubo para coagulación debe ser el primer tubo
tomado cuando hay varias tomas que incluyan
anticoagulantes mas fuertes: EDTA, heparina-litio
y activadores de coagulación
 Se necesitara de un tubo de descarte si la toma se
realiza con mariposa y tubos de longitud variable
 Los tubos deben llenarse completamente a la
marca del fabricante y no menos al 90% de su
capacidad
 Este efecto depende de la concentración de
citrato y del tamaño del tubo, y es mas sensible al
3,8% y en tubos pediátricos
 No debe transferirse muestra de un tubo a otro,
así los 2 sean para hemostasia. Nunca pasar de un
tubo con EDTA, heparina-litio o que contenga
activadores de la coagulación a un tubo con
citrato
Anticoagulante
 Todas las muestras deben ser tomadas en tubos con
citrato de sodio al 3,2% o 3,8% (109mM – 129mM)
 La guía actual del CLSI favorece el uso de citrato de
sodio al 3,2%, salvo pruebas específicas
 El uso de citrato al 3,8% tamponado puede sobrestimar
el TP y el TTP y subestimar el fibrinógeno si el rango
referencial fue hecho en base a citrato al 3,2%
 Contrariamente, el uso de citrato al 3,8% puede proveer
una muestra mas estable para evaluar respuesta a la
terapia antiplaquetaria.
 La recomendación N° 1 es estandarizar la concentración
de citrato y determinar rangos referenciales apropiados
con la misma concentración del anticoagulante.
Orden de extracción en la toma de muestra

 Extracción de varios tubos

1)Cultivos 2)Coagulación 3)Suero
4)Heparin 5)EDTA 6)Inhibidor glicolítico
 Orden simple para coagulación
• TP o TTPa ………... …no requiere tubo de descarte
• Otros analítos ........requiere tubo de descarte
 Mariposa
• Requiere tubo de descarte para llenar el espacio muerto del
tubo: asegurar relación ST/AC 1:9
 Cateter permanente
• Enjuage con 5mL de cloruro de sodio y descarte 6 espacios
de volumen muerto del tubo: minimiza la contaminación
con heparina
CLSI (NCCLS) Guidelines-Fourth Edition December 2003; H21-A4 vol. 23 No. 35
Llenado correcto del tubo
Transporte de muestras
 Las muestras deberían ser transportadas según las recomendaciones
actuales de la guía CLSI H21 – A5
 No refrigeradas y a T° ambiente (15 – 22 °C), en el mas breve tiempo
que sea posible
 Idealmente, las pruebas de coagulación de rutina como el TP y el
TTPa, deben ser realizadas dentro de las 4 horas, aunque la
tolerancia permitida puede ser mayor que estas
 El monitoreo de heparina no fraccionada por TTP, debe ser realizado
preferiblemente antes de la hora, por causa de la potencial
neutralización de heparina por las plaquetas liberadas.
 Temperaturas extremas deben ser evitadas
 Demora en el transporte puede afectar a los factores lábiles (FV y
FVIII) conduciendo a tiempos de coagulación prolongados y perdida in
vitro de actividad de factor
 En esos casos, la centrifugación local y la separación del plasma
seguido de congelación y transporte congelado del plasma debe ser
considerado.
Proceso y almacenamiento de
muestras
 La mayoría de las pruebas de coagulación requieren de una
centrifugación, pero hay pruebas como el anticoagulante lúpico que
requieren 2 centrifugaciones, para asegurar preparaciones libre de
plaquetas antes de la congelación
 La centrifugación es esencialmente a temperatura ambiente (15 – 22°C),
aunque la centrifugas refrigeradas son también recomendadas
 La centrifugación se lleva a cabo a 3500 rpm (1500 g) por 10 – 15 minutos
 Una mayor fuerza de centrifugación no es recomendada porque produce
hemolisis y activación plaquetaria
 No es recomendable usar los frenos de la centrifuga
 Se recomienda doble centrifugación si la muestra va a ser congelada
 Algunas pruebas requieren un procesamiento diferente (Ej. Agregación
plaquetaria)
 La estabilidad de las muestras para hemostasia
depende de varios factores:
 Sistema de extracción utilizado
 La muestra es almacenada después de la centrifugación
o como sangre total
 La temperatura de almacenamiento
 El sistema reactivo/instrumento utilizado
 Parametro a ser analizado
 Hoy ya no se aconseja almacenar sangre total porque
conduce a la activación del FVII, FVIII, FvW y otros
Congelación - Descongelación
 Las muestras previamente congeladas deberían ser
descongeladas en baño maría a 37°C por 5 – 10 min
 Se debe monitoreara de cerca la anticoagulación para evitar un
exceso de tiempo
 La integridad de la muestra puede quedar comprometida si no
es completamente descongelada o permanece demasiado
tiempo a 37°C
 Se debe controlar rigurosamente la temperatura del baño maría
para evitar temperaturas superiores a 37°C
 Una vez descongelada la muestra es imperativo que la muestra
se mezcle adecuadamente y completamente antes de ser
procesada
 En general para proporcionar la mayor integridad a
la muestra, esta debería ser procesada dentro de la
primera hora después de la extracción, o dentro de
las cuatro primeras horas ( de lo contrario separar el
plasma y congelarlo).
 El plasma separado puede ser mantenido a
temperatura ambiente o refrigerado por pocas horas
sin un efecto adverso en la coagulación. Sin
embargo, aconseja la congelación.
 Como regla general las muestras congeladas a -20°C
deben ser procesadas antes de 4 semanas. Las
muestras congeladas a -80°C pueden durar varios
meses o hasta varios años
Consideraciones para una muestra
de calidad en hemostasia
 Anticoagulantes  Tiempo para el ensayo
 Relación sangre total –  Reactivos
anticoagulante (1:9)
 Rangos de referencia
 Hematocrito
 Coágulos pequeños
 Hemólisis
 Flebotomista
 Plasma pobre en
 Paciente (variabilidad
plaquetas
biológica )
Un resultado verdadero hace la diferencia

 Un falso normal podría evitar más pruebas de diagnóstico

 Un hemofílico sangra durante la cirugía
• Un falso anormal podría conducir a mayores costos y pruebas
innecesarias
 la ansiedad del paciente y mayores gastos
• Un falso resultado bajo o alto para el monitoreo de anticoagulación
 Paciente en riesgo de trombosis o hemorragia
• Un ensayo DRVVT normal Falso
 paciente no tratado con terapia anticoagulante y desarrolla
trombosis
• Falso diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand
 tratamiento inapropiado con concentrado de factor y/o
afecta la calidad de vida debido a la etiqueta de por vida de
la enfermedad
 Aguja

 Calibre pequeño = disrupción y hemolisis

• medida basada en el paciente y el volume sanguíneo
• calibre 19 – 23 para adultos, y aún 25 puede ser usada
• Jeringa/aguja incrementa el riesgo de hemólisis
• Mariposa …puede ser necesario para ciertos pacientes
• catéter permanente debería ser evitado
Tipo de tubo
 Se prefiere los tubos de extracción al vacio
 Vidrio siliconado o plástico de polipropileno
 Tubos de pequeño diámetro aumentan la activación plaquetaria

Torniquete
 No más de 1 minuto

 El paciente no debe bombear abriendo y cerrando la mano (cambio en proteínas de

coagulación)

 Puede causar activación de plaquetas

Hemolisis

Factores procoagulantes
• Lisis de hematíes produce presencia de factor tisular, liberación de
ADP y factores procoagulantes
• La presencia de estos factores activan las plaquetas
• Se activa la cascada de coagulación
• Los resultados de coagulación son afectados en función del nivel de
hemólisis
• El efecto es dependiente del paciente (condiciones hereitarias o
adquiridas del paciente, infecciones severas, CID, Rxns de
transfusión)

Cambio del color de la muestra

• Posible efecto en el resultado basado en la tecnología (optpmecánica)
Hemolisis

 Tiempo del torniquete prolongado ( no mas de un minuto)

 No permitir que el alcohol se seque antes de la punción
venosa
 La aguja se ocluye cuando esta demasiado cerca de lumen
de brazo ... el flujo sanguíneo es lento
 Agujas de pequeño calibre causan trauma y lisis de
hematíes
 Trasvase vigoroso de la muestra de la jeringa al tubo
 Mezcla vigorosa o fuerte agitación
 El calor excesivo o la exposición al frío
 Traumatismos mecánicos durante el transporte al
laboratorio
Efecto de la Hemolisis

Resultados incrementados
 Tiempo de protrombina
 Dimero – D

Resultados disminuidos
 TPPa
 Antitrombina
 Fibrinógeno
Hematocrito
 Un Hto > a 55% requiere el ajuste del la cantidad de
anticoagulante, porque se viola la relación ST/AC, y el
anticoagulante pasa a estar en exceso y alterará todas las
pruebas de coagulación

 (100 – Hto) x 1 Vf (100 – 65) x 0.27 = 0.157 mL

60 10 60
Ejemplo: paciente con 65% de Hto y un tubo de 2.7 mL
Un tubo de 2.7 mL tiene 0.3 mL (300 µL) de anticoagulante, la
nueva muestra tendrá que ser tomada solo con 157 µL, es decir, se
deberá remover del tubo primario 143 µL
Existen otras formulas para la corrección del anticoagulante
Centrifugación y alicuotas

 Objetivo = Plasma pobre en

plaquetas(PPP)

conteo plaquetario <10,000/uL

1,500 g por 15 minutes a temeperatura

ambiente

centrifuga de cabezal oscilante

recomendada para evitar la remezcla
de plasma y plaquetas

Validar centrifuga y recuento de

plaquetas cada 6 meses
Porqué plasma pobre en plaquetas ? ……..
Porqué importa ?

 las plaquetas son fuentes de

fosfolípidos
 Los reactivos son fosfolípidos
 Pueden acortar resultados si las
plaquetas reaccionan con reactivos
de fosfolípidos
Actividad física, estrés y enfermedad
 La actividad física vigorosa en pacientes inmediatamente antes de
la toma de muestra conduce a cierta eventos en vivo (por ejemplo,
expansión del volumen plasmático y aumento del metabolismo
basal), que a su vez pueden dar lugar a efectos significativos en la
hemostasia.
 Los efectos agudos más conocidos están relacionados con reactantes
de fase aguda, que puede aumentar debido a la actividad física,
enfermedad o estrés, e incluyen: fibrinógeno, FVW y FVIII.
 En el peor de los casos, estas elevaciones pueden dar lugar a un
diagnóstico erróneo de (leve) hemofilia A o EvW tipo 1 en pacientes
como un no hemofílico o un no VWD (falsos negativos).
 La toma de muestra puede a veces ser estresante para algunos
pacientes (especialmente niños) que conducen a cambios de fase
aguda en proteínas secundarias a la flebotomía.
Alteraciones causadas por estrés
y ejercicio

Prueba Efecto
Factor VIII Aumento de nivel plasmático
Función plaquetaria Afecta la segunda fase de la
agregación de ADP y epinefrina
Conteo de plaquetas Aumenta
Fibrinólisis Aumenta
 Fármacos que afectan las pruebas
de laboratorio en hemostasia

Prueba Medicamento Efecto

Factores II, V, VII, VIII, IX y Anticonceptivos orales Aumento de actividad
XII
Adhesión y agregación Anticonceptivos orales Aumento de actividad
plaquetaria
Tiempo de protrombina Anticoagulantes orales Interfieren en el ciclo de la
Vit. K
TTPa o TT Heparina no fraccionada Inhibe al factor X y II (TTPa
↑↑)
Plaquetas Aspirina y AINES Antiagregantes. Inhiben a la
ciclooxigenasa para la
síntesis de tromboxano A2
Orden Clínica y solicitudes inapropiadas
como cuestión preanalítica

 La forma como se solicita una orden para hemostasia,

también se considera como una cuestión pre-analítica,
debido al cantidad de pedidos inadecuados que se dan.
 Solicitud de las pruebas en el momento adecuado: la
solicitud demasiado pronto después de una trombosis
puede conducir a una falsa conclusión de una deficiencia.
 El FVIII puede elevarse post – trombosis y esto haría que se
pierda la detección de un AL, si las pruebas de tamizaje son
solo coagulométricas
 La heparina y la warfarina pueden interferir en la adecuada
identificación de un AL
 Considerado de otro modo, más del 80% de los resultados
anormales de las pruebas de trombofilia puede ser un
reflejo de evaluación inapropiada durante el tratamiento
anticoagulante
Resumen

 Las muestras de coagulación están sujetas a una serie

de variables pre-analíticas
 Tiempo desde la toma de muestra hasta el ensayo es
fundamental para los resultados de coagulación
 La hemólisis tiene un efecto adverso sobre los
resultados de la coagulación
 Manejo de la muestra puede alterar los valores de
resultado
 Las variables de los pacientes contribuyen en los
resultados de las pruebas de hemostasia
 Cuando los resultados no tengan sentido ... considerar
variables pre-analíticas