BIOLOGIA MOLECULAR

ADN RECOMBINANTE
ALEXANDER PISCONTE GUERRA
SILVIA MELISA BUHEZO BORDA
 ETAPAS DEL DESARROLLO DEL DNA RECOMBINANTE

1869 Miescher, aislo por primera vez el ADN

1944 Avery,demostró que el ADN y no la proteína contiene la información
genética
1953 Watson y Crick, propusieron el modelo de doble hélice para la estructura del
DNA, basados en los resultados de Franklin y
1957 Komberg, descubrió el DNA Polimerasa I, la enzima que se utiliza para
producir sondas de DNA marcadas.
1961 Marmur y Daty, descubrieron la renaturalización del DNA, estableciendo las
reacciones de hibridación de ácido nucleicos
1962 Albert, proporcionó la existencia de las nucleasas de restricción del DNA,
que condujo a la purificación y uso de la secuencia del DNA por parte de
Nathans y H. Smith
1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana, dilucidaron el código genético
1967 Geller, descubrió el DNA LIGASA,la enzima para unir fragmentos de DNA
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 ADN RECOMBINANTE

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula

de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión
de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN
recombinante en un organismo, se produce una modificación genética
que permite la adición de una nueva secuencia de ADN al organismo,
conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de
nuevos rasgos. La producción de una proteína no presente en un
organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se
llaman proteínas recombinantes.
CLONACION DE ADN

▪ La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias

idénticas de un fragmento particular de ADN. En un procedimiento
típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de
interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente
importante) se inserta primero en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y
pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN
ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
 ADN RECOMBINANTE

Principios de 1970: DNA Molecula + díficil analizar

Enormemente larga
Químicamente monótona
Actualmente: DNA molécula + fácil de estudiar
Es posible separar regiones del DNA
Obtenerlas en cantidades ilimitadas
Determinar su secuencia de nucleótidos
Un gen puede ser alteradoy transferidos a celulas en cultivo
 DNA RECOMBINANTE

IMPACTO EN LA BIOLOGIA CELULAR:

Determinar las funciones de muchas proteínas
Desenmarañar Complejos mecanismos de Regulación génica
Disponer de grandes cantidades de proteínas minoritarias
 ETAPAS DEL DESARROLLO DEL DNA
RECOMBINANTE

1972-1973 Se desarrollo las técnicas de clonaje del DNA en los laboratorios de Bayer
Cohen, Berg, en la Universidad de Stanford y la universidad de California en
San Francisco

1975 Sanger y Barrel y Maxan Y Gilbert, desarrollaron métodos rápidos de secuenciación

del DNA

1981-1982 Palimiter y Brinster, produjeron un ratón transgénico. Spradling y Rubin

produjeron vinagre transgénico

1985 Mullis y Colaboradores, inventaron la PCR.

 TECNICAS UTILIZADAS DEL DNA
RECOMBINANTE

Utilización de Ruptura especifica del DNA, facilita el aislamiento y manipulación

Nucleasas de de los genes individuales
Restricción
Secuenciación La secuencia rápida de los nucleótidos de fragmentos purificados de
ADN, determina los limites precisos de un gen, y la secuenciación de
amino ácidos que codifica
Hibridación de los Hace posible localizar secuencias de ADN o ARN, con una gran
ácidos nucleicos exactitud y sensibilidad utilizando la capacidad que tiene estas
moléculas de unirse a secuencias complementarias de ácidos
nucleicos
Clonación del DNA Se puede conseguir que un fragmento de DNA, se integren un
elemento génico, autoreplicante que habita en una bacteria, de tal
manera que de una mólecula de DNA, puede ser reproducido
muchos miles de millones de copias idénticas
Ingeniería Genética Se pueden alterar secuencias de DNA, produciendo versiones
modificadas de los genes, los cuales se pueden reinsertar en celular
ENZIMAS UTILIZADAS EN LA TECNOLOGIA DEL
DNA RECOMBINANTE

ENZIMA FUNCION
Endonucleasa de Restricción del tipo II Romper el DNA por secuencias especificas
DNA ligasa Unir dos moléculas o fragmentos
DNA Polimerasa I Rellenar los huecos del DNA Duplex mediante
adición escalonada de nucleótidos,en el
extremo 3
Transcriptasa Inversa Hacer una copia del DNA a partir de una
mólecula del RNA.
Polinucleotido Quinasa Añadir un grupo fosfato al grupo OH, del
extremo 5 de un polinucleótido para marcarlo
o para permitirle una ligación
Transferencia Terminal Añadir colas Homopoliméricas, al grupo OH
del extremo 3, de una hebra del DNA.
Exonucleasa III Eliminar residuos nucleótidicos del extremo 3,
de una hebra de DNA
 ENZIMAS UTILIZADAS EN LA TECNOLOGIA
DEL DNA RECOMBINANTE

ENZIMA
EXONUCLEASAS DEL BACTERIOFAGO
FOSFATASA ALCALINA
FUNCION
Eliminar nucleotidos del extremo 5, de un
dúplex para exponer los extremos 3
monohebra
Eliminar fosfatos terminales de extremo 5 ó 3
o de ambos.
PROCESO GENERAL EN LA CONSTRUCCIÓN
DE ADN RECOMBINANTE
PROCESO GENERAL EN LA CONSTRUCCIÓN
DE ADN RECOMBINANTE
PROCESO GENERAL EN LA
CONSTYRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE
VECTORES DE LA ClONACIÓN
VECTORES DE LA ClONACIÓN
VECTORES DE LA ClONACIÓN
VECTORES DE LA ClONACIÓN
BIBLIOTECA DE GENES
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CLONADAS
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CLONADAS
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CLONADAS
ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
CLONADAS
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
CLONADAS
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
CLONADAS
ELECTROPORACIÓN
GRACIAS