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plan

 Introduction
 Définition
 intérêt
 Détermination de la séquence en acides
aminés
I. Préparation de la protéine pour le
séquençage:
II. Séquençage des chaines polypeptidiques:
III. Reconstitution de la séquence complète
Introduction:
Rôles des
protéines

structure

La chaine
Acides aminés
polypeptidique

séquençage
Définition:
La nature Le nombre L’ordre

La stratégie de base

Frederick Sanger 1953

La première séquence:
l’insuline
Intérêt du séquençage:

Comprendre le mécanisme d’action au


niveau moléculaire

Comparaison des séquences de


protéines analogues//fonctionnement

Clinique, diagnostique des mutations


Détermination de la séquence en
acides aminés :

Préparation Séquençage Reconstitution


de la des chaines de la structure
protéine polypeptidi- complète
pour le ques
séquençage
I. Préparation de la protéine
pour le séquençage:
1. Déterminer le nombre de chaines
polypeptidiques: analyse des
groupements terminaux

2 types de
Résidus N ch
insuline terminaux polypep
Phe et Gly en
nombre =
Identification des résidus Nterminaux:
 Méthode de Sanger(FDNB)
 Méthode des dansylaminoacides:
 Méthode d’Edman:
 Méthodes enzymatiques: exopeptidase ;
aminopeptidase :

hydrolysent séquentiellement les acides aminés


depuis l’extrémité N-terminale d’un polypeptide
Identification des résidus C terminaux:
 Hydrazinolyse:
un polypeptide est traité par l’hydrazine
anhydre à 90°C pendant 20 à 100 heures
toutes les liaisons peptidiques sont rompues
et tous les résidus sont transformés en
hydrazides sauf le résidus C-terminale que
l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre
façile à isoler et à identifier par
chromatographie
Identification des résidus C terminaux:
 Hydrazinplyse:
un polypeptide est traité par l’hydrazine
anhydre à90°C pendant 20 à 100 heures
toutes les liaisons peptidiques sont rompues
et tous les résidus sont transformés en
hydrazides sauf le résidus C-terminale que
l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre
facile à isoler et à identifier par
chromatographie
 Méthode enzymatiques :
carboxypeptidase
2.Coupures des ponts disulfures:
Réduction par le 2-mercaptoethanol:
3. Séparation purification des chaines
polypeptidiques

Urée
Milieu acide ou
Ion
basique,
Guanidinium
C saline élevée,
SDS
T° élevée

chromatographie
4. Détermination de la composition
en acides aminés:

Hydrolyse des
liaisons Analyse qualitative
peptidiques et quantitative;
chromatographie
Hydrolyse des liaisons peptidiques:

Hcl 6M Trp
Hydrolyse Hydrolyse
100-120°C Hydrolyse
Gln Glu
acide base enzymatique
24H Asn Asp
NaOH
hydrolyse 2-4M Cys Ser
basique 100°C Thr Arg
4-8H
un mélange
Hydrolyse déterminati de
enzymatiqu on de: peptidase;
e Trp Gln pronase[1]
(streptomyces
Asn griséus)
II. séquençage des chaines
polypeptidiques:

1. Réaction d’hydrolyse spécifique:

2. Séparation purification des fragments:

3. Détermination de la séquence en AA des


fragments:
 Réaction d’hydrolyse spécifique:

Bromure de les fragments <40-


cyanogène: 100AA ayant
après Met

N-
Bromosuccinimide
HOBr:après Tyr
hydrolysésTryen petits
fragments

HydroxylamineNH2
OH: hydrolyse les
liaisons Asn-Gly
hydrolyse spécifique
chimique,enz
 Réaction d’hydrolyse spécifique
 Séparation purification des
fragments:

Dénaturant :
Urée , SDS HPLC
Support de Phase inverse
CHromato
Détermination de la séquence en AA des
fragments:

les petits
fragments

cycles
répétés
(Edman)

dispositif
automatiq
Reconstitution de la séquence
complète :

Mise en ordre des fragments


LABORATOIRE DE BIOCHIMIE
CHU CNE

Dr. BENDJAZIA
 MCB. ALLOUI. AS
2016