Projeto de BIO018 – Biologia Molecular para Biologia

Caracterização funcional da proteína expressa do gene dinP

de Herbaspirillum rubrisubalbicans
CAMPOS, I. S. L.¹, KOSHI, L. Y.¹, LESSMANN, D.¹, NEUNDORF, A. C. A.¹, NEUNDORF, A. K. A.¹

¹ Universidade Federal do Paraná

Av. Cel. Francisco Heráclito dos Santos, S/N CEP: 81531-980 – Jardim das Américas – Curitiba – Paraná

INTRODUÇÃO
Herbaspirillum rubrisubalbicans é uma bactéria diazotrófica encontrada no solo ou em associação endofítica com gramíneas de interesse econômico. Foi primeiramente identificado
como um fitopatógeno, porém, devido sua capacidade de converter N2 em compostos assimiláveis pelas plantas, é um potencial promotor de crescimento vegetal . Foi analisado
1, 2, 3, 4
uma sequência do genoma de H. rubrisubalbicans (seq. 116), afim de identificar genes codificantes para proteínas, suas regiões promotoras, terminadores, sequências consenso e sítios de
ligação ao ribossomo. Após identificação, foi proposta uma análise funcional da proteína expressa do gene dinP, a partir da indução de expressão em E. coli por meio da técnica de
clonagem gênica.

METODOLOGIA
Análise da sequência no Artemis Alinhamento
das sequências PCR
Corte do vetor e inserto
com enzimas de
PCR restrição:
XhoI e BamHI

Regiões promotoras, terminadores e Eletroforese

RBS dos genes da sequência

inserto

Após o corte

RBS das enzimas de

restrição o
vetor e o DNA ligase
inserto são
unidos pela
Transformação por choque térmico em BL21(DE3)pLysS com ação da DNA
mutação para dinP ligase
Análise de outras características como a presença/ausência Análise da
de mRNA e rRNA, família, regiões conservadas, proteínas atividade
semelhantes, entre outras. PCR enzimática e vetor
Controle sequenciamento
(sem IPTG) das cepas de
bactérias clonadas

Expressão com
indução por IPTG IPTG

SDS - PAGE
Meio de cultura com Ampicilina Purificação

RESULTADOS E DISCUSSÃO

dinP Temperatura de
Sequência Enzima de restrição no primer Tm (°C) GC (%)
anelamento (°C)
5’GCACTCGAGATGAAC
Primer 1 XhoI 62,6 63
CCGC3’
dnapol fY* 66
3’GCAGGATCCTCAGGA
Primer 2 BamHI 63,6 57
dnaE AGAGAAGG5’
Figura 1: representação das regiões onde foram encontrados genes após
análise das ORFS no programa Artemis. Figura 2: representação do alinhamento Figura 9: primers utilizados na amplificação do gene dinP
de aminoácidos do gene DinP.

5’... ...3’
5’... ...3’
3’... ...5’ Figura 6: proteína expressa do gene dinP
3’... ...5’

Figura 7: Domínios conservados da proteína A superexpressão da DNA

polimerase IV e análise
5’...
...3’ das sequências da cepa
utilizadas podem revelar
3’... ...5’

atividade mutagênica não

Figura 3: representação do fragmento 116 com a representação dos genes dinP, dnaE e dnapol fY *, respectivamente (em azul, genes direcionada, como já foi
completos; em vermelho, genes incompletos na sequência), a localização das regiões RBS (amarelo), start codon (roxo) e stop codon (azul
claro). encontrada em Escherichia
Gene (locus) Proteína coli .
Número de bases 5901 Figura 8: Proteínas relacionadas à dinP 5
dinP (Hrubri_4247) DNA polimerase IV
Porcentagem de GC 63,89%
Subunidade alfa da DNA DNA polimerase IV*:
Número total de ORFs 30 dnaE (Hrubri_4248)
polimerase III • Não apresenta atividade exonuclease
mRNA NA 3’ – 5’
rRNA NA dnapol fY *(Hrubri_4249) DNA polimerase da família Y
• Relacionada com proteção UV
Figura 4: informações relacionadas a sequencia Figura 5: genes encontrados na sequência 116 e seu produto proteico. • Mutagênese não direcionada Figura 10: vetor pET 16b com o inserto do gene dinP em posição
obtidas após análise no Artemis. NA – não
apresentou

REFERÊNCIAS
1. MONTEIRO, Rose A. et al. Genomic comparison of the endophyte Herbaspirillum seropedicae SmR1 and the phytopathogen Herbaspirillum rubrisubalbicans M1 by suppressive subtractive hybridization and partial genome AGRADECIMENTOS:
sequencing. FEMS Microbiology Ecology, v. 80, n. 2, p. 441-451, 2012.
2. ALMEIDA CHAVES, Valfredo et al. Desenvolvimento inicial de duas variedades de cana-de-açúcar inoculadas com bactérias diazotróficas. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v. 39, n. 6, 2015.
3. SILVA GIRIO, Lucas Augusto da et al. Bactérias promotoras de crescimento e adubação nitrogenada no crescimento inicial de cana-de-açúcar proveniente de mudas pré-brotadas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, p. 33-43, 2015.
4. VALDAMERI, Glaucio et al. Herbaspirillum rubrisubalbicans, a mild pathogen impairs growth of rice by augmenting ethylene levels. Plant molecular biology, v. 94, n. 6, p. 625-640, 2017.
5. WAGNER, Jérôme et al. The dinB gene encodes a novel E. coli DNA polymerase, DNA pol IV, involved in mutagenesis. Molecular cell, v. 4, n. 2, p. 281-286, 1999.