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Cuantificación de proteínas en muestras de suero, esplenocitos y

PBMC’s mediante el ensayo de BCA


E. Paredes1, L. Troya1, P. Yánez1, M. Torres Arias1,2
1Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura, Laboratorio Docente de Inmunología.
2Centro de Nanociencia y Nanotecnología - CENCINAT, Universidad de Las Fuerzas Armadas - ESPE, Sangolquí, Ecuador.
Correo electrónico del autor correspondiente: emparedes3@espe.edu.ec, lktroya@espe.edu.ec, pjyneza@espe.edu.ec, mmtorres@espe.edu.ec

INTRODUCCION

El kit de BCA está diseñado para la detección y cuantificación de proteínas totales. Está
basado en el método de ácido bicinconínico (BCA), el cual genera una reacción
colorimétrica detectable a 562 nm [1].
El ensayo BCA tiene muchas ventajas sobre otras técnicas de cuantificación puesto que el
complejo de color es estable, hay menos susceptibilidad a los detergentes hasta el 5 % y es
aplicable en un gran rango de concentraciones de proteínas [2].
Las proteínas son parte importante en la estructura celular, por lo cual su cuantificación es fundamental para el estudio
de las mismas en una infinidad de ámbitos por ello es necesario que se utilicen métodos sencillos mediante como en
los que se da una reacción fácil de medir y visualizar [3]. BCA es ampliamente usado ya que permite estudios de
interacciones proteína:proteína, medición de fracciones de columna, estimación del porcentaje de recuperación de
proteínas de membrana de extractos celulares y alto rendimiento en detección de proteínas de fusión [5].
METODOLOGIA RESULTADOS
 Curva de calibración:
Cálculo de la Absorbancia neta (An)
𝐴𝑛570 = 𝐴570𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴570𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜

Se realizaron diluciones de 1/2 (50ul [Prot] (ug/mL) An (570 nm)


muestra y 50ul de PBS) y 1/4 (25ul
muestra y 75 ul PBS) de las muestras Se colocaron 100ul de las
muestras, sus diluciones, el 30 0,111
obtenidas en prácticas anteriores: Se colocó 100ml de una
Albúmina y proteínas.- 1/2 y 1/4: blanco y una proteína conocida solución preparada con los 10 0,047
Células de bazo.- 1/2; Células de otorgada por la docente en las reactivos de kit en cada pocillo
hueso.- 1/4 filas 5 y 6 de la placa 0,5 0,01

 Cálculo de concentraciones
Determinación de la An de todas las
muestras y cálculo de la [Proteínas]
Figura 1. Curva de Calibración An570= a[Proteína]’’+b
La ecuación de la curva de calibración respecto al estándar es [Proteína]’’=295,0723*An570-3,0245
Y=0,003389X+0,01025
Se cellaron las placas para Se midieron las absorbancias [Proteína]= [Proteína]’’ * FD
llevarlas a incubar por 30 usando un espectrofotómetro
minutos a 37°C para microplacas C u a n t i f i c a c ió n d e P r o t e ín a s
Volumen total
2500
FD =
A lb ú m in a Volumen muestra
C o n c e n t r a c ió n ( u g /m L )

2000 Ig

Cálculos para la C o n tro l


Albúmina Ig
Distribución de las muestras en las 1500 Diluciones
preparación del reactivo E s p le n o c ito s
PBM C
(ug/mL) (ug/mL)
placas dado por el Kit 1000 1 69,12069 253,0983
1/2 228,7695 507,6129
500
1/4 756,3882 1006,964
0 Esplenocitos PBMC's
Diluciones
(ug/mL) (ug/mL)
/2

/4
1

D ilu c io n e s 1/2 1079,788


1/4 1379,522
Figura 2. Cuantificación de Proteínas
Dilución Control (ug/mL)
Tomando en cuenta la dilución (D) se determinó que las muestras
de PBMC’s tenían la mayor [proteínas]=1379,952 ug/mL. 1 163,888

CONCLUSIONES
BCA permite la cuantificación de proteínas en un Para la cuantificación precisa de una proteína
El ensayo BCA está basado en la reducción del
Cu, causada principalmente por cuatro amplio rango de trabajo 20-2000 µg/mL [5] desconocida, es recomendable seleccionar un
residuos de aminoácidos que incluyen cisteína Considerando el factor de dilución de cada estándar de proteína conocida similar en calidad a
o cistina, tirosina y triptófano, presentes en las muestra se determinó las concentración de las la desconocido. En el ensayo realizado la proteína
moléculas de proteína. A diferencia de los proteínas analizadas, para esplenocitos fue 1079,8 conocida estándar fue γ-globulina bovina (BGG)
métodos de unión al colorante de Coomassie, ug/mL, para PBMCs 1379,52 ug/mL, para un estándar adecuado para inmunoglobulina,
en BCA, el esqueleto peptídico universal Inmunoglobulinas 253,81 ug/mL y para proteínas esplénicas y de PMBCs. Sin embargo,
también contribuye a la formación de color, Albúmina 228,77 ug/mL ug/mL, todos los no para albumina [5].
ayudando a minimizar la variaciones por las valores en el rango de cuantificación descrito.
diferencias de composición de proteínas[4]
RECOMENDACIONES
El ensayo BCA a pesar de ser un método de cuantificación proteico
El ensayo por BCA es ligeramente susceptible a la El método BCA no es un verdadero método de punto final, rápido, requiere de un periodo de incubación de 30 min a 37ºC. Se
interferencia de químicos presentes en las muestras de por lo que el color final continúa desarrollándose, por lo presenta el ensayo BCA de Pierce Rapid Gold que usa la misma
proteínas, incluidos los agentes reductores (Ej: β- que su desarrollo debe ser rápido. Sin embargo, después de tecnología quelante, proporciona una precisión comparable pero con una
mercaptoetanol), quelantes de cobre (Ej:EDTA) y la incubación, la tasa de desarrollo continuo del color es lo incubación de 5 minutos a temperatura ambiente y se mide a 480
tampones con alta concentración, estas interferencias suficientemente lenta como para permitir que se analicen nm. Esta mejora elimina la necesidad de esperar o exponer las muestras a
se pueden evitar generando muestras diluidas. juntas grandes cantidades de muestras.
temperaturas elevadas y un mejor tiempo de obtencionde resultados [6].

REFERENCIAS
[1] PB-L. (Julio de 2016). qPROTEIN (BCA). Obtenido de http://www.pb-l.com.ar/wp-content/uploads/2016/07/RA03-qPROTEIN.pdf
[2] Sigma. (s.f.). Cuantificación de proteínas. Obtenido de Kit de Acido Bicinchoninico: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/protein-quantitation/bicinchoninic-acid-kit.html
[3] Cacio, M., Contreras, J., & Hernández, M. A. (28 de Mayo de 2017). Cuantificación de proteínas de leche por método de Bradford. Obtenido de
https://www.academia.edu/33383848/Cuantificaci%C3%B3n_de_prote%C3%ADnas_de_leche_por_m%C3%A9todo_de_Bradford
[4] He, F. (2011). Ensayo de proteína BCA (ácido bicinconínico). Bio-protocolo Bio101: e44. DOI: 10.21769 / BioProtoc.44 .
[5] Termo Sientific (2013) Pierce™ BCA Protein Assay Kit. Obtenido: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
[6] Termo Sientific (2013) Pierce™ Rapid Gold BCA Protein Assay Kit