Proteine RIP izolate la specia

Momordica charantia
UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA DIN IASI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA: GENETICA MOLECULARA
 Cuprins
• Introducere
• Momordica charantia
• Proteine RIP la M.charantia
• α și β momordine
• Proteina MAP30
• Producerea biotehnologică a metaboliților secundari la M.charantia
• Embiogeneză somatică la M.charantia
• Proteina MAP30 recombinantă
• Concluzii
• Bibliografie
 Introducere
• Este cunoscut faptul ca, de mult timp, plantele reprezintă o sursă naturală de substanțe
chimice ce pot fi utilizate pentru tratamentul bolilor.
• Produsele naturale din plante au furnizat industriei farmaceutice una dintre cele mai
importante surse de compusi de ‘’grei’’ si pana la 40% din medicamentele moderne sunt
derivate din surse naturale, utilizand fie substanta naturala, fie un derivat sintetic.
• O multitudine de plante prezinta cai metabolice specifice pentru producerea unor
molecule mici ca alcaloizi și flavonoide, de asemenea cu potential terapeutic.
• Plantele mai sintetizează și o serie de proteine valoroase larga răspândite în regnul
vegetal, găsindu-se în diferite țesuturi. Aceste proteine, denumite proteine RIP, au rol în
mecanismele de apărarea ale plantelor, prezentând activitate antivirală, antifungică și
insecticidă.
 Momordica charantia
• Momordica charantia cunoscută si sub numele de castravetele amar, face parte
din familia Cucurbitaceae si creste in zonele tropicale din Amazon, India, America
de Sud si Caraibe. Este utilizată in tratarea cancerului, diabetului zaharat, icterului
si pneumoniei.
• Desi cercetările nu au fost definitivate, componentele principale responsabile
pentru proprietățile hipoglicemiante ale Momordica charantia sunt peptide
insulin-like, momordina și de asemenea, numeroase alte componente, inclusiv
proteine, glicozide, saponine și minerale, vitaminele A și C și beta-caroten.
• Extractele de Momordica Charantia s-au dovedit a inhiba cresterea și proliferarea
diferitelor tipuri de celule canceroase la animale și în vitro. Acest efect poate fi
atribuit fie unui inhibitor puternic al guanilat ciclazei, o enzimă prezenta in
cantitati mari in multe tipuri de tumori canceroase, fie modificării sistemului
imunitar (prin diminuarea secreției intestinale de interleukina-7 la pacienţii cu
cancer, reducerea numărului de limfocite și cresterea populației T-helper și a
celulelor natural killer).
• În 1978, au fost izolate două lectine din Momordica charantia care au inhibat
sinteza proteinelor în celulele Ehrlich și apoi denumite aglutinina si momordina.
• În 1981, a fost izolată o proteină cu puternică activitate antivirală – MCI (
Momordica charantia inhibitor).

Fig.1. Fruct și semințe de Momordica charantia ( sursa:

https://www.amazon.ca/Seeds-Momordica-charantia-Bitter-
Organically/dp/B00HBSZKSQ)
 Proteinele RIP la M.charantia
• Proteinele RIP sunt N-glicozidaze toxice care depurinizează buclele α ale ARN
ribozomal. Acest proces impiedică ribozomii să mai participe la sinteza proteinelor.
• Mai tarziu, a devenit evident ca proteinele RIP sunt capabile sa dezactiveze si
substraturile de acid nucleic nonribozomal. In ultimul deceniu acestea au devenit
subiectul unei game largite de investigatii in activitati antivirale, anti- tumori,
antimicrobiale si imunomodulatoare.
• Exista 2 tipuri de RIP care au fost izolate din plantele , semintele si radacinile unei mari
varietati de plante. Proteinele RIP de tip 1 sunt un lanț unic care conține un domeniu de
activitate al N-glucozidazei ARN.
• Tipul II RIP: proteine ce au în alcatuire doua lanturi polipeptidice, un lant A si un lant B
(lectină ce se leagă de molecule glucidice de tipul galactozei).
Tipuri de proteine RIP din M. charantia
 Momordinele Alfa si Beta

• Momordinele Alfa si beta sunt cele douaproteine RIP izolate din seminte de M. charantia.
Momordinele sunt glicoproteine de baza cu un singur lant si par a avea 2 forme inrudite.
• Alfa -Momordina are un continut de zahar neutru de aproximativ 1.6% iar Beta- momordina
este o glicoproteina cu un continut neutru de zahar de 1.3%.
• Ambelor momordine le lipseste capacitatea de hemaglutinare.
• De asemenea, ambele poseda structura si proprietati biologice similare dar sunt diferite din
punct de vedere imunologic.
• Activitatea lor biologică include: inducerea avortului în sarcini avansate,efect inhibitor asupra
creșterii tumorale, efect imunosupresor, inhibitoral activității HIV, compusi antifungici.
 MAP 30
• O alta proteina studiata la nivel extins dupa momordinele alfa si beta din M. charantia
este MAP 30 ( proteina momordica anti-HIV). A fost izolata din seminte de M charantia
intr-o maniera similara cu cea a momordinelor alfa si beta. Proteina a fost purificata prin
schimb de ion si cromatografie cu filtrare prin gel.
• Ca structura, MAP30 este o proteina cu un singur lant care contine 263 de reziduuri de
aminoacizi cu 30 de reziduuri de aminoacizi esențiali care in sumeaza cca 11% din totalul
de aminoazici si al pH ului de baza.
• Greutatea moleculara a MAP30 este de 30kDa.
• Activitatea biologică a acestei proteine este reprezentată de inhibarea a sintezei proteice,
efect antitumoral, antibacterian, antiviral și efect ant-replicare al virusului HIV.
• Momordinele alfa si beta au fost primele RIP izolate din seminte de M charantia si studiate pentru activitate anti HIV. Ambele au inhibat
activitatea expresiei antigenului HIV in celulele T infectate si cand au fost testate ca terapie medicamentoasa folosita pentru tratarea
infectiile cu HIV la oameni. Momordina alfa a arătat inhibarea completă a inversului transcriptazei (RT) în celulele infectate cu HIV și
inhibarea a fost realizată la concentrații de proteine antivirale la care celulele sănătoase (neinfectate) au fost în mare parte neafectate.
• Proteinele RIP de la M. charantia au demonstrat activitate antitumorală in vitro și in vivo. MAP30 a prezentat activitate antitumorală
împotriva anumitor celulele tumorale umane, celule renale, celule pulmonare si cancer mamar. MAP30 are citotoxicitate preferențială
pentru celulele leucemice umane, fiind de cel puțin 10 ori mai puternice și uciderea celulelor leucemice în comparație cu limfocitele
periferice din sangele uman normal. MAP30 de asemenea a prezentat o activitate antitumorală in vivo împotriva inhibitorului estrogenic
și a tumorei de sân umană metastazica atat in vitro cat si in vivo.
• A fost observată inhibarea expresiei celulelor antigenului tumoral mamar al genei HER2 in vitro in cazul celulelor de cancer de san
MAP30 tratate MDA-MB-231. Proteinele RIP din M. charantia posedă proprietăți antivirale cu spectru larg împotriva diferitelor virusuri
care includ virusurile ARN și ADN prin inhibarea sintezei proteinelor virale în celulele infectate. Observațiile că proteinele M. charantia
au fost eficiente împotriva unui număr de viruși diferiți cuplat cu capacitatea sa de inactivare a ribozomilor eucarioti in vitro, a sugerat că
mecanismul de acțiune anti-virală ar putea fi cauzate de inactivarea ribozomilor gazda în celulele infectate cu virus.
 Embriogeneză somatică la M. charantia

• Biotehnologiile moleculare pentru obținerea de metaboliți secundari de la M.charantia se realizează utilizând culturi de calus, suspensii celulare, embriogeneză somatică, obținerea
de „hairy roots„ și lăstari, tehnici de ADN recombinant.
• Scopul utilizării procedurii de inducere a embriogenezei somatice este acela de a facilita transformările genetice la M.charantia.
• Pentru obținerea culturilor de calus s-au utilizat frunze de la plantuțe de 30 de zile, obținute în condiții de laborator, puse pe mediu MS, conținând vitamine MS, sucroză 3%, 0,8% bacto-
agar și 2,4D, pH 5,8 înainte de autoclavare. Culturile au fost menținute la temperatura de 25±2ºC, 16 ore la lumina, 8ore la întuneric. După 21 de zile, 90% din explante au generat calus
friabil.
• Suspensiile celulare au fost obținute transferandu-se 500 mg calus friabil în pahare Erlenmeyer de 125 ml, pe 25 ml mediu MS lichid suplimentat cu tiamina HCl, myo-inositol, sucroză
30g/L și diferite concentrații de 2,4D. (0,0-2,0mg/L), plasate peagitatoare. Subcultivarea s-a realizat o dată pe săptămână (10ml mediu). După14 zile, 50 mg de celule filtrate au fost
subcultivate pe mediu lichid MS, suplimentat cu 2,4D (1,5ml/L).
• Microscopic, analizandu-se celule din suspensii de 7 zile, s-au observat două tipuri de celuleȘ celulesferice, cu nucleu evident, citoplasmaă densă și celule alungite, cunumeroase vacuole si
fara nucleu aparent. Celule sferice sunt cele care au devenit masă pre-embriogenă. Ulterior au fost observate stadiile de dezvoltare specifice:
• stadiul globular (10 zile),
• stadiul cordiform (după 7 zile de la transferul pe MS lichid fără fitohormoni),
• stadiul torpedo (după alte două săptămâni)
• Stadiul cotiledonar .
 6,2% din embrionii obținuți au devenit plante adulte în sere.
80% din calusul friabil obținut a generat embrioni somatic.
 Proteina MAP30 recombinantă

• Clonele genomice și de ADNc care codifică MAP30 din M. charantia au fost clonate pe baza datelor
referitoare la unele secvențe partiale de aminoacizi.
• Cu ajutorul unor primeri specifici pentru secvențele de interes, prin intermediul PCR, aceste gene au fost
multiplicate. Genele responsabile de codificarea MAP30 au fost clonate și într-un vector procariot
pET28a, pentru identificarea rapidă a clonei poyitive s-a utilizat PCR.
• Recombinarea MAP30 a fost exprimata in cucurbitacee de consum si fructele acestora precum dovleacul,
catravetele si pepenele ofera o alternativă bioactivă disponibilă pe cale orală pentru această proteină
antivirală.
• Au fost efectuate studii pentru modificarile chimice pe MAP 30 prin reacția reziduurilor de aminoacizi
vizate din peptidă cu un agent de derivatizare organic capabil de reacție cu lanțurile laterale selectate sau
reziduurile terminale S-a constatat că astfel de fragmente au îmbunătățit solubilitatea, absorbția și
jumătatea din biologică de viață a MAP30.
 Concluzii
• Proteinele RIP din M. charantia posedă proprietăți antivirale cu spectru larg împotriva
diferitelor virusuri care includ virusurile ARN și ADN prin inhibarea sintezei proteinelor
virale în celulele infectate.
• Observațiile că proteinele M. charantia au fost eficiente împotriva unui număr de virusuri
diferite si capacitatea sa de inactivare a ribozomilor eucarioti in vitro, a sugerat că
mecanismul de acțiune anti-virală ar putea fi cauzate de inactivarea ribozomilor gazda în
celulele infectate cu virus.
• Biotehnologiile moleculare pentru obținerea de metaboliți secundari de la M.charantia se
realizează utilizând culturi de calus, suspensii celulare, embriogeneză somatică, obținerea
de „hairy roots„ și lăstari, tehnici de ADN recombinant.
 Bibliografie

• M. Puri, I. Kaur, R.K. Kanwar, R.C. Gupta, A. Chauhan and J.R. Kanwar (2009) Ribosome
Inactivating Proteins (RIPs) from Momordica charantia for Anti Viral Therapy .
• Prarthna Daniel, Ujjwala Supe, M.G.Roymon (2014) A review on Phytochemical analysis of
Momordica charantia.
• Thiruvengadam, M., Varisai Mohamed, S., Yang, C.H, Jayabalan, N., Developement of an
embryogenic suspension culture of bitter melon (Momordica charantia L.), Scientia
Horticulturae, 109, pg. 1236-129, 2006
• https://www.amazon.ca/Seeds-Momordica-charantia-Bitter-Organically/dp/B00HBSZKSQ