UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

E.A.P DE MEDICINA

CÁTEDRA DE HISTOLOGÍA

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

DRA. PATRICIA CONTRERAS VERA

MEDICO PATÓLOGO
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA HISTOLOGÍA Y MORFOLOGÍA CELULAR

Especificar las herramientas que utiliza la

Objetivo General : Histología para el estudio ultraestructural de
tejidos y de la célula como unidad morfológica y
funcional del organismo

Contenido:  Histología.
 Concepto y aplicaciones Científicas y clínicas.
 Técnica Histológica.
 Etapas en la preparación de tejidos para su estudio
al microscopio óptico.
 Histoquímica y Citoquímica
 Microscopía.
¿QUE ES LA HISTOLOGÍA?

Etimológicamente: histo= tejido logos: estudio

Es la rama de la Biología encargada del análisis microscópico de

la anatomía celular y tisular de los tejidos biológicos.

Marcello Malpighi es reconocido como el fundador de la

Histología. Las primeras investigaciones histológicas se hicieron
en el siglo XVII gracias a la invención del microscopio óptico por
Antonio Van Leeuwenhoek
 ¿QUÉ ES LA ANATOMÍA?

Es el estudio de la forma y la estructura de los organismos vivos organizados

Anatomía Macroscópica: Estudio de las estructuras observables a simple vista.

Anatomía Microscópica: Es aquella que requiere de auxiliares ópticos.

¿QUÉ ES LA CITOLOGÍA o BIOLOGÍA CELULAR?

Es una disciplina académica que se encarga del estudio de las células en

cuanto a lo que respecta a las propiedades, estructura, funciones, organelos
que contienen, su interacción con el ambiente y su ciclo vital.
La Histología representa un nexo de unión
entre la Bioquímica, la Fisiología, la
Anatomía, la Genética, la Clínica y la
Patología.
 TÉCNICA HISTOLÓGICA

ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS REALIZADOS PARA OBTENER

PREPARADO HISTOLÓGICO
PREPARADO HISTOLÓGICO:

Es una rebanada de tejido colocada sobre una lámina

portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina
cubre-objetos.
TÉCNICA HISTOLÓGICA
DEFINICIÓN:

La técnica histológica, es el conjunto de operaciones a que se

somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al
microscopio.
Técnicas Histológicas:

Se realizan una serie de pasos para la preparación del tejido

para su posterior estudio en el microscopio

La técnica mas comúnmente utilizada en los laboratorios de

histotecnología es la de la Parafina.

Están relacionadas con los avances de la microscopía.

Pasos de la Técnica:
Para su realización se efectúan una serie de pasos secuenciales
ordenados:

1. Obtención de la muestra
2. Fijación de la muestra
3. Deshidratación
4. Aclaramiento
5. Inclusión
6. Corte
7. Coloración
8. Montaje
1. Obtención de la Muestra:

Puede provenir el material humano:

 las necropsias,
 las biopsias
 las piezas quirúrgicas.

De éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos

últimas proporcionarán tejidos patológicos.
 Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver.

 Biopsias: tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto

de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico
histopatológico.

 Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las

intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos
inflamados, también pueden darnos material de investigación pero,
como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica
Obtención de la Muestra:

Autopsias-Necropsias Biopsias
Tipos: Tipos
 Medicolegales  Incisionales
 Hospitalarias  Excisionales
 Transoperatorias
 Por Aguja
Citología Exfoliativa
BIOPSIA:

 Es un procedimiento realizado
con el propósito de obtener
tejido o células del cuerpo para
examinarlos con el microscopio.
Biopsias:
Tipos de biopsias:
 La biopsia endoscópica.

 La biopsia de la médula ósea.

 La biopsia excisional o inscisional.

 La biopsia de aspiración por medio de una aguja fina.

 Una biopsia de perforación.

 La biopsia de raspado.

 La biopsia de la piel.
 ENDOSCOPISTA TOMANDO MUESTRA

PACIENTE REALIZANDOSE
ENDOSCOPIA

RESULTADO DE LA BIOPSIA
Los sitios comunes para las biopsias son:

 La médula ósea.
 Los senos.
 El tracto gastrointestinal.
 El riñón.
 El hígado.
 El pulmón.
 Los nódulos linfáticos.
 La piel.
 La tiroides.
 El cerebro.
Después de una biopsia, la muestra de tejido se envía a una de las
siguientes áreas de la Anatomía Patológica para que la examinen y la
analicen:

 La patología quirúrgica.
 La citología.
 La autopsia.
BIOPSIA POR CONGELACION:
Técnica utilizada para evaluar inmediatamente el tejido obtenido
durante el acto quirúrgico para poder tomar una conducta
terapéutica con el diagnostico anatomopatologico.

PASOS:
1. Congelación de la muestra del tejido
( anhídrido carbónico).
2. Corte del tejido congelado (criostato)
3. Tinción de los cortes
H-E y azul de metileno

El proceso dura unos 10 minutos

BIOPSIAS TRANSOPERATORIAS:

 Se realiza rápidamente durante el acto

quirúrgico para decidir un conducta médico
quirúrgica.

 El tejido en fresco sin fijación se congela a altas

temperaturas con la utilización de un aparato
llamado CRIOSTATO.
BIOPSIAS POR CONGELACIÓN- CRIOSTATO

Criostato: Consta de un micrótomo tipo Minot

incluido en una cámara de congelación. El
volante de inercia que controla la realización del
corte permanece en el exterior, mientras que la
cuchilla y el mecanismo de avance están
situados dentro de la cámara fría (normalmente
a -20º C).
Citología Exfoliativa:

Utilidad:
 Descarta Malignidad
 Determinación de Sexo
 Estudio Hormonal
CITOLOGÍA EXFOLIATIVA:

 Citología exfoliativa: estudio citológico

de las células exfoliadas de un órgano en
comunicación con el exterior o fácilmente
accesible: cérvix y/o vagina, bronquios,
mucosa oral, estómago.
CITOLOGIA EXFOLIATIVA O PAPANICOLAU

 Es una técnica que nos sirve para detectar precozmente

el cáncer cervicouterino.
Citología cervicovaginal:
 La toma citológica cervicovaginal consiste en pasar suavemente un
algodón y una espátula de madera por el cuello uterino
El procedimiento es indoloro.

 El moco obtenido que contiene células se deposita en un pequeño

cristal (portaobjetos) y se tiñe con diversos colorantes. Más tarde se
examinan al microscopio las características de forma, tamaño,
coloración..., etc., que tienen las células.

 Distintas células de aspecto normal.

 CITOLOGIA EXFOLIATIVA

Los pasos a seguir en la toma de citología son:

PAPANICOLAU
 Anamnesis y registro para citología.
 Preparación de las láminas.
 Toma de la muestra utilizando espátula de
madera o plástico para el exocérvix y cepillo
para el endocérvix, teniendo en cuenta:
 No hacer tacto vaginal antes de la toma de la
muestra.
 Usar espéculo sin lubricante.
 Exponer muy bien el cérvix.
 Limpiar el exceso de flujo con torunda de
algodón.
 Extender la muestra en forma adecuada para que quede
delgada.

 Fijar la muestra utilizando cito-spray, fijador comercial o

alcohol al 95%.

 Identificar adecuadamente la lámina.

 Informar a la usuaria sobre la importancia de reclamar

oportunamente el resultado.
CITOLOGIA EXFOLIATIVA

1. Infección:
- Vaginosis Bacteriana
- Tricomonas
- Clamydia
- Herpes
2. Otros:
- Cambios reactivos
- Cambios reparativos
- Inflamación por atrofia
Citología Cervicovaginal:
La biopsia dirigida y el curetaje endocervical pueden arrojar cualquiera
de los siguientes resultados anatomopatologicos:

· Negativa para neoplasia

· Infección por VPH

· NIC de bajo grado: NIC I

· NIC de alto grado: NIC II, NIC III

· Neoplasia microinfiltrante: escamocelular o adenocarcinoma

· Neoplasia infiltrante: escamocelular o adenocarcinoma

 CITOLOGÍA
EXFOLIATIVA

CITO BRUSCH
• La citología exfoliativa oral se define como
el estudio e interpretación de los
caracteres de las células que se
descaman, natural o artificialmente, de la
mucosa oral.
• Consiste en observar al microscopio la
morfología de las células epiteliales
superficiales después de su toma, fijación
y tinción.
• Es una técnica sencilla, no agresiva,
relativamente indolora y bien aceptada por
los pacientes, por lo que podría ser útil en
el diagnóstico precoz del cáncer oral.
2. FIJACION:

La fijación tiene por objeto la conservación celular,

evitando su destrucción.

Por lo tanto es un método histológico destinado a

obtener preparados duraderos que conservan la
estructura morfológica y química de las células.
 FIJACIÓN:
La fijación tiene por objetivo:

 Mantener el tejido en estado natural

y evitar su desintegración o su
autolisis.

 Endurecer el material.

 Eliminar bacterias u otros agentes.

Fijación de la muestra.
FIJADORES:
 Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes
físicos que se utilizan para tal fin.

Cualidades que debe tener un fijador:

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que
aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis,
desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta
hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban
in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para
su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).

5. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.

6. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o

quebradizos
 TIPOS DE FIJACION

• Fijación por inmersión: • Fijación por perfusión:

el tejido se sumerge en las El órgano que debe fijarse, se
soluciones fijadoras. infiltra con el medio de fijación a
través de su propio sistema
vascular.
 Tipos de fijadores Físicos y Químicos

FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.
Fijadores Químicos:

FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los
casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se
trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 o 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy
bien estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
FIJADORES COMPUESTOS:

a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.

b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.

c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.

d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética

3. DESHIDRATACION:
 Las piezas al ser retiradas del fijador, o
después de haberlas lavado, están Deshidratación en alcoholes
sucesivos
embebidas en agua; impidiendo que sean
penetradas por la parafina.
 Por lo tanto, en primer lugar, debemos
deshidratar los tejidos sumergiéndolos en
líquidos anhidros, ávidos de agua.
 Para evitar alteraciones provocadas por
una deshidratación brusca, se aconseja
proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etílico de
graduación creciente.
4. ACLARAMIENTO:
Impregnación por un disolvente de la parafina

 Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el

disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros
utilizamos). Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna
turbidez.

 Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido

bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto.
PENETRACIÓN EN PARAFINA

Penetración de la parafina
 Se sumergen las piezas en
parafina (56-58º de punto de
fusión), mantenida líquida en la
estufa a no más de 62ºC.

 Después de 1 a 2 horas se
renueva la parafina.
 5. Inclusión en parafina:

Inclusión definitiva o formación del bloque:

 En moldes de papel o de metal ad-hoc
(barras de Leuckart) se vierte la
parafina fundida, del mismo punto de
fusión de la que ha servido para la
penetración.
 Se colocan las piezas orientándolas y
luego se pone el molde en heladera.
 A los 15-30 minutos la parafina se
habrá solidificado completamente.
 6. CORTE:

 El objeto de la inclusión es hacer posible la

reducción del tejido a cortes lo
suficientemente delgados como para
permitir el paso de la luz para examinarlo al
microscopio.

 Los micrótomos son instrumentos de gran

precisión que nos proporcionan cortes
delgados parejos y de espesor graduable.

 Los cortes más corrientes son los de 4-6

micras.
Tipos de Microtomo:
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la
cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al
que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.

- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se

desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se
hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de
cinta.

- Tipo Criostato
 7. Coloración:
Clasificación de los colorantes:

Según su origen se clasifican en:

COLORANTES NATURALES:

- Animales (carmín)

- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):

- Ácidos: Sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes

citoplasmáticos.

- Básicos: Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de

metileno). Son colorantes nucleares.

- Neutros: Sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el

citoplasma de otro.

- Indiferentes: No forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del

líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
COLORACIÓN:

Las coloraciones pueden ser:

- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la

solución colorante empleada.

- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe

con un color diferente al del colorante empleado.
COLORACION:
Colorantes más utilizados en histología humana:
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes
oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes
artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato
potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de
lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como
mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este
caso como un colorante indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos
halogenados con tres grupos arilo).
-Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.
Imagen de microscopía óptica de una sección de piel humana
teñida con Hematoxilina-Eosina, con un aumento de 40x.
 PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos
(mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células
caliciformes en el intestino.

 Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de rojo la

queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada para los cortes de
piel).

 Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico rugoso y los

corpúsculos de Nissl en las neuronas.
 COLORANTES Y REACCIONES HISTOLOGICAS COMUNES

REACTIVO RESULTADO

Hematoxilina Azul: núcleo; regiones acidas del

citoplasma; matriz del cartílago

Eosina Rosa: regiones básicas del citoplasma;

fibras de colágena.

Tricómica de Masson Azul oscuro: núcleo

Rojo: musculo, queratina, citoplasma
Azul claro: mucinógeno, colágena.

Acido peryóico de Schiff Magenta: moléculas ricas en glucógeno y

carbohidratos.

Colorante de Wright y Giemsa Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos

(células sanguíneas) Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos.
 REACTIVO NUCLEOS CITOPLASMA FIBRAS FIBRA
COLAGENAS ELASTICAS
T
i Hematoxilina y Azul violeta Rojo o Azul violeta Rojo Sin tinciön o rosa
n Eosina (H-E) (ribosomas y
c
RER)
i
o Azan Rojo brillante Rosa palido o azul Azul Sin tinciön o rojo a
n tenue. azul rojizo
e
s (abundan,
ligamentos.
h
Para elastina Negro violeta (r-f)
i
s (resorcina-fucsina o rojo pardo (o)
t u orcreina)
o
Van gieson Azul negro Amarillo o Rojo Sin tinciön
l
ó parduzco claro. especial
g Tricomica de Pardo negro Rojo ladrillo. Verde Sin tinciön.
i
Goldner
c
a EH (hematoxilina Heterocromatina y Centriolos, Sin tinciön Gris tenue.
s ferrica) de nucleolo azul cinocilios, especial o gris
Heindenhain. negro amarillento.
Tinciones histoquímicas
Reacción de PAS
Tinción rojo violeta. El acido
peryodico grupos aldehídos en el
glucógeno y el los componentes
sacáridos de las glicoproteínas.
El reactivo de Schiff los tiñe de
rojo violeta

Azul alciano Tinción azul. Polianiones: moco

sulfatado, glucosaaminoglucanos,
hialuranos.

Lípidos (Sudan III, Negro, aceite rojo Naranja-rojo o pardo… Lípidos

0)
Tinción d Feulgen para ADN Tinción purpura
Azul de toluidina Tinción azul. Tiñe la cromatina
(ADN), el nucléolo y los ribosomas.
 INMUNOHISTOQUIMICA

ES UNA TECNICA DE COLORACION QUE PERMITE

DETECTAR IN SITU COMPONENTES CELULARES O

EXTRACELULARES (ANTIGENOS), POR MEDIO DE

ANTICUERPOS ESPECIFICOS, EMPLEANDO PARA ELLO,

SISTEMAS DE DETECCION ENZIMATICOS.

8. Montaje:
 Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la
aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un
preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente
para evitar su deterioro.

 La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.

 La aclaración se realiza con xilol.

 El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del

Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de
refracción semejante al del vidrio.

 Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita

sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se
cubre con un cubreobjeto.
 Reglas Básicas para el diagnóstico
de un preparado Histológico

 Mírese el preparado a simple vista: Determinar si es un órgano

macizo o hueco, bordes son artificiales o naturales.
 Mírese con el microscopio con el aumento menor y determinar si hay
una organización definida ( Corteza y Medula).
 Examínese todo el corte minuciosamente con los aumentos menor-
mediano.
 Procédase descripción de formas, disposición, coloración,
relaciones, comparaciones , identifique y defina.
 Solo utilícese gran aumento para detalles celulares.
A TRAVES DE LOS PREPARADOS
HISTOLOGICOS DESCRIBIR,
IDENTIFICAR, COMPARAR,
CLASIFICAR, DEFINIR,
EXPLICAR E INTEPRETAR.