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Introdução às técnicas

de biologia molecular
PROFA. ANA PAULA BARTH
O número de bases A
tem que ser igual ao de
T, enquanto o número
Relembrando... Pentose
de bases C será sempre
igual ao de G.

Dois anéis
interligados

Apenas um anel
Como a vida se perpetua ao longo do tempo?
Descreva o processo de replicação do DNA.
Descreva o processo de replicação do
DNA.
A produção de uma proteína.
Metodologias laboratoriais e moleculares
em genética
Métodos mais utilizados em Genética e que
possibilitam investigar a função de proteínas
individuais, bem como realizar análises de larga
escala em genomas
Técnicas de hibridização que permitem, por
exemplo, a identificação da expressão gênica do
genoma completo
Essas metodologias foram chamadas de tecnologia
do DNA recombinante, com as quais genes
específicos puderam ser isolados em quantidade,
modificados e reintroduzidos em células e até em
organismos.
Métodos de purificação de ácidos
nucleicos
A extração e purificação dos ácidos nucleicos são as
primeiras etapas a serem realizadas
independentemente do que se deseja analisar
A maioria das técnicas os extrai, ou separa do
restante da célula, tanto DNA quanto RNA, e,
dependendo do objetivo da análise, eles devem ser
separados entre si.
◦ A origem do material genético pode ser de
amostras de sangue, bulbo capilar, entre outros
Extração do DNA – 5 ETAPAS
1) Compreende a lise celular, ou seja, o rompimento da célula por
métodos químicos ou físicos para acessar o DNA.
2) Os lipídios, especialmente os de membrana, são removidos com
o uso de detergentes, como SDS, e por centrifugação
3) A remoção das proteínas do extrato celular é feita a partir de
desnaturação proteica, por ação de proteases, e separação por
centrifugação e/ou filtração.
4) Os ácidos nucleicos de interesse são extraídos com fenol,
precipitados por ultracentrifugação ou métodos cromatográficos
(troca iônica, filtração em gel), agregados e
5) Diluídos normalmente em etanol.
Extração do DNA
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
o Permite a amplificação de segmentos da molécula
de DNA.
Componentes da análise:
◦ DNA com uma sequência-alvo para ser
amplificada,
◦ Uma DNApolimerase termoestável,
◦ dois oligonucleotídeos iniciadores (primers)
◦ desoxirribonucleotídeos conhecidos como dNTPs,
◦ tampão de reação e concentração adequada de
cloreto de magnésio (MgCl2).

o Termociclador, que possibilita o aquecimento e o


resfriamento rápido das amostras.
Reação em cadeia - Exponencial

Cada ciclo
dobram as
quantidades de
fragmentos,
então 25 ciclos
125
Eletroforese
A separação das moléculas de DNA e de RNA é
feita pela técnica de eletroforese em gel, em que
as moléculas lineares de DNA são separadas de
acordo com seu tamanho
DNA são submetidas a um campo elétrico, por
uma matriz de gel que é semelhante a uma
gelatina, porém porosa.
Quando o DNA é submetido a um campo
elétrico, suas moléculas que têm carga negativa
migram por meio do gel em direção ao polo
positivo.
Eletroforese
Essas moléculas de DNA são flexíveis e ocupam um
volume efetivo na matriz do gel, que atua como uma
peneira por onde passam tais moléculas.
Moléculas grandes de DNA possuem mais dificuldade de
passar através dos poros do gel e, por isso, migram mais
lentamente do que as moléculas menores de DNA.
Após o período de migração ou corrida do polo negativo
para o polo positivo pelo gel, as moléculas de tamanho
diferentes podem ser separadas, pois percorrem
diferentes distâncias.
Eletroforese
Para analisar os
resultados do
experimento de
eletroforese em
gel é preciso corar
o DNA no próprio
gel, a fim de que o
torne visível
Eletroforese
Atualmente, os laboratórios
utilizam corantes não
mutagênicos que coram o DNA
de verde ou azul, e alguns
deles não necessitam de luz
UV para serem visualizados; já
o brometo de etídio é um
poderoso e perigoso
mutagênico e sua radiação
pode causar queimaduras
severas.
Proteômica
O conjunto proteínas expressas por um genoma é chamado de proteoma,
Identificação completa de proteínas produzidas por uma célula ou tecido
que é conhecida como proteômica

As principais técnicas utilizadas na análise proteômica estão envolvidas no


fracionamento das proteínas, e os métodos mais utilizados são: eletroforese em gel
de poliacrilamida, que conta com a presença do detergente dodecil sulfato de
sódio (SDS); eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida; e a
cromatografia líquida, que pode envolver a cromatografia de afinidade, fase
reversa ou troca iônica.
Exercicio
Qual a faixa contém o fragmento de DNA mais longo

Qual a faixa contém o fragmento de DNA mais curto.

Qual a faixa contém um fragmento de DNA de


1500 pares de base (bp).
Quatro faixas são numeradas no gel acima. (A
faixa é um corredor através do qual o DNA passa
assim que sai de um poço.)
Exercicio
A reação em cadeia de polimerase (PCR, polymerase chain reaction) é um método de tubo de
ensaio para amplificar uma seqüência selecionada de DNA. Sobre esta técnica, é correto
afirmar:
A ) Este método pode ser utilizado para amplificar seqüências de DNA de qualquer organismo,
bactéria, vegetal ou animal, com exceção do DNA viral, cuja amplificação não pode ocorrer na
ausência da célula viva.
b) Cada ciclo de amplificação dobra a quantidade de DNA em uma amostra, levando ao aumento
exponencial do DNA em ciclos repetidos de amplificação.
c) Não é necessário conhecer a seqüência do nucleotídeo do DNA-alvo; porém, é necessário
conhecer a seqüência de nucleotídeos de segmentos curtos em cada lado do DNAalvo.
d) Em análises forenses, o DNA isolado de um único fio de cabelo é insuficiente para determinar
a origem da amostra se a técnica do PCR for utilizada isoladamente.
e) As principais desvantagens da técnica do PCR em relação à clonagem como mecanismo de
amplificação de uma seqüência específica de DNA são a baixa velocidade, o alto custo, e a
impossibilidade de se trabalhar com pequenas quantidades iniciais de DNA.
Exercicío
A reação em cadeia da polimerase (PCR, na sigla em inglês) é uma técnica de biologia molecular
que permite replicação in vitro do DNA de forma rápida. Essa técnica surgiu na decada de 1980 e
permitiu avanços científicos em todas as áreas de investigação genômica. A dupla hélice é
estabilizada por ligações hidrogênio, duas entre as bases adenina (A) e timina (T) e três entre as
bases guanina (G) e citosina (C). Inicialmente, para que o DNA possa ser replicado, a dupla hélice
precisa ser totalmente desnaturada (desenrolada) pelo aumento da temperatura, quando são
desfeitas as ligações hidrogênio entre as diferentes bases nitrogenadas.
Qual dos segmentos de DNA será o primeiro a desnaturar totalmente durante o aumento da
temperatura na reaçao de PCR?
Qual dos segmentos de DNA será o primeiro a
desnaturar totalmente durante o aumento da
temperatura na reação de PCR?
A reação da cadeia da polimerase (PCR, do inglês, Polimerase Chain Reaction) é uma técnica com
múltiplas aplicações na biologia molecular. A partir de uma molécula de DNA inicial (DNA molde) tem-
se milhões de cópias do fragmento de DNA desejado.
Na primeira etapa da técnica, ocorre a desnaturação da dupla fita de DNA em fitas simples, pelo
aumento da temperatura (95oC). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida (em torno de 50oC)
para que os oligonucleotídeos se liguem às regiões complementares. Na terceira etapa, a enzima
DNA polimerase reconhece o oligonocleotídeo ligado e catalisa a polimerização das fitas, inserido os
nucleotídeos e formando novas fitas de DNA. Esse ciclo é repedido de 30 a 40 vezes, de forma que o
fragmento de DNA é amplificado.
Ao aumentar e reduzir a temperatura, as ligações entre as fitas da molécula de DNA são desfeitas e
refeitas, respectivamente. Que tipo de ligação presente na molécula de DNA permite esse fenômeno?
ligação fosfodiéster
ligação de hidrogênio
ligação covalente
ligação peptídica
ligação iônica
Exercicio
Testes de paternidade comparando o DNA
presente em amostras biológicas são cada vez
mais comuns e são considerados praticamente
infalíveis, já que apresentam 99,99% de acerto.
Nesses testes podem ser comparados fragmentos
do DNA do pai e da mãe com o do filho. Um teste
de DNA foi solicitado por uma mulher que queria
confirmar a paternidade dos filhos. Ela levou ao
laboratório amostras de cabelos dela, do marido,
dos dois filhos e de um outro homem que poderia
ser o pai. Os resultados obtidos estão mostrados
na figura abaixo.
Que resultado a análise mostrou em relação à
paternidade do Filho 1? E do Filho 2? Justifique.

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