MAIN VARIABLES AFFECTING A CHEMICAL-ENZYMATIC

METHOD TO OBTAIN PROTEIN AND AMINO ACIDS FROM

RESISTANT MICROALGAE
 INTRODUCCION
• Uno de los factores más importantes para lograr una producción de microalgas a una escala comercial económica y
ambientalmente factible es el desarrollo de sistemas de cultivos sostenibles (Richmond, 2004), a partir de variables
como el pH, la temperatura, la luz y la concentración de nutrientes (Moreno et al, 2012).

• En el caso de las proteínas y los aminoácidos es preferible usar métodos suaves, aunque a veces no logran romper la
pared celular y liberar la mayoría de las moléculas intracelulares, lo que da lugar a rendimientos de extracción bajos.

• En cuanto a los métodos alcalinos, investigaciones anteriores han demostrado que las altas alcalinidades inducen el
debilitamiento de la pared celular y la extracción de proteínas de las microalgas. Además, los métodos asistidos por
enzimas basados en proteasas mejoran la extracción y la producción de aminoácidos a partir de la biomasa de
microalgas.

• Este estudio pretende evaluar las principales variables que afectan a un método de extracción que consiste en un
proceso enzimático secuencial alcalino, con extracciones separadas y pH no controlado, para obtener proteínas y
aminoácidos de biomasa fresca de microalgas resistentes. El proceso incluye dos reacciones/extracciones secuenciales:
una reacción alcalina para la interrupción de la célula y la primera extracción de proteínas, seguida de una reacción
enzimática con una proteasa comercial, para la extracción adicional y la hidrólisis de las proteínas liberadas. La
evaluación se realizó mediante un consorcio de microalgas compuesto por Nannochloropsis sp como especies
predominantes. Se realizaron diagramas de Pareto para conocer la influencia significativa positiva o negativa. Además,
se realizaron diagramas de superficie de respuesta con un diseño compuesto centrado en la cara (CCD) de acuerdo con
los resultados arrojados por los diagramas de Pareto, a fin de observar el efecto que tienen las interacciones entre las
variables significativas sobre la producción de proteínas.
FIGURA 1: Efecto del pH de la primera
extracción alcalina sobre el rendimiento de
extracción de proteínas (% de proteína total)
diferenciando entre las dos extracciones
secuenciales alcalinas y enzimáticas. Las
barras apiladas representan los resultados
parciales obtenidos en la primera extracción
alcalina (proteínas) y la segunda extracción
enzimática (diferenciación entre péptidos y
aminoácidos). Las líneas representan la
tendencia de los mismos resultados parciales y
generales.
Tabla 2: Diseño experimental y resultados
del CCD centrado en la cara.
TABLA 3: Coeficientes de regresión, valores
F y valores p de las variables e
interacciones en los modelos de
ecuaciones.
 Figura 2: Diagramas de pareto que muestran los efectos
estandarizados de las variables e interacciones en el rendimiento
de extracción total de (a) proteína (% del total de proteínas) y (b)
FAN (% de la biomasa total).
 FIGURA 3: Diagramas de superficie de respuesta que muestran (A) el efecto de la
concentración de biomasa y el tiempo de la reacción alcalina sobre el rendimiento de
proteína (% del total de proteína) (te = 120 min Y te = 60°C) Y (B) la efecto de la
concentración de biomasa Y el tiempo de la reacción enzimática en el rendimiento de
FAN (% de la biomasa total) (ta = 120 min Y te = 60°C).
TABLA 4: VALORES ÓPTIMOS DE LOS FACTORES PARA MAXIMIZAR LAS
DIFERENTES VARIABLES DE RESPUESTA.
Variable de Respuesta*
Término P F P+F [P] P + [P] Todo

Tiempo de la reacción
alcalina (ta) 120.0 108.0 106.0 111.3 111.2 106.7
(min)

Tiempo de la reacción
enzimática (te) 120.0 120.0 120.0 120.0 120.0 120.0
(min)

Temperatura de la
reacción enzimática (Te) 60.0 58.0 60.0 60.0 60.0 60.0
(°C)

Concentración de
biomasa (Bc) 50.0 150.0 102.1 150.0 104.0 121.3
(mg.ml−1)

P 82.0 54.1 68.3 54.4 67.8 63.0

Respuesta pronosticada F 0.66 1.16 1.02 1.17 1.02 1.09
[P] 8.9 15.3 14.4 16.2 14.5 15.5
* P: rendimiento proteico; F: rendimiento de FAN; +: optimización combinada; [P]=concentración de proteína en el extracto final; Todos: optimización combinada de P + F + [P].
 Figura 4: Efecto de tres concentraciones
de biomasa en los rendimientos de
extracción de proteína (% de proteína
total) y FAN (% de biomasa total) y en la
concentración de proteína en el extracto
final (mg.Ml−1), diferenciando entre el
primer grupo alcalino y segunda extracción
enzimática.
Extracción asistida con proteasas, aunque
utilizando un proceso de ph controlado.
 RESUMEN
• En el trabajo de investigación nos brinda información teórica y práctica acerca del desarrollo de microalgas evaluando las
variables que afectan los métodos de extracción para obtener proteínas aminoácidos con un alto rendimiento, por ello se estudió
una metodología de superficie de respuesta en donde el método se basa en un proceso alcalino enzimático secuencial, con
extracciones separadas y pH no controlado y se aplicó a la biomasa fresca de una especie resistente compuesto principalmente de
Nannochloropsis sp., como especies predominantes, entre los factores más importantes que afectan el rendimiento de obtención
esta la concentración de biomasa que fue el factor más importante que afectó el proceso general. Los ensayos con valores de
optimizados alcanzaron rendimientos máximos de 80.3% y 1.07% de proteína (% proteína total.) y FAN (% biomasa total), y por
ello en el rendimiento de proteínas, el efecto de la concentración de biomasa fue negativo y en FAN fue positivo, para lo cual el
efecto negativo de la concentración de biomasa probablemente fue causando por la dilución del medio alcalino por el volumen
elevado en concentraciones de biomasa, por eso esto afecta negativamente tanto la primera extracción alcalina como la posterior
extracción enzimática, debido al menor debilitamiento de la pared celular producida y por otro lado la reducción con el tiempo se
debe probablemente a las propiedades de amortiguación de las proteínas liberadas, , entre las variables más importantes y que
fueron evaluadas son el tiempo de la reacción alcalina que tuvo un efecto positivo en el rendimiento global de la extracción de
proteínas, principalmente debido a su efecto en la extracción en la primera reacción alcalina. Ya que la superficie muestra que el
rendimiento de extracción disminuye notablemente con la concentración de biomasa y rendimiento aumentó con el tiempo de la
reacción alcalina y la aplicación de más tiempo en la reacción alcalina no es suficiente para alcanzar una mejora sustancial del
rendimiento.
• Se realizaron diagramas de Pareto para conocer la influencia significativa positiva o negativa de las variables de estudio sobre los
datos obtenidos con el diseño de experimentos, y se tuvo en cuenta que las variables cuando cruzan el umbral, existe significancia
con un valor p < 0,05.
 METODOLOGÍA
• La especie predominante fue identificada por la evaluación morfológica, que pertenece a los géneros de Nannochloropsis sp. Las cultivos crecieron en botellas de vidrio
de borosilicato de 5 L bajo diferentes condiciones como la luz, fotoperiodo 12/12 h y temperatura controlada por un acondicionador de aire (23-26°C). La fuente de
carbono como CO2 puro, fue burbujeada por mezcla con aire en los fotobiorreactores desde el fondo, previamente filtrado a través de 0,22 μm filtros. El aire y los
nutrientes se suministraron utilizando medio Combo, enriquecido en nitrógeno (10 mM) y fósforo (0,5 mM), proporcionando un exceso de estos nutrientes para
maximizar el contenido de proteínas en la biomasa. Los cultivos se llevaron a cabo en el modo discontinuo durante 7 días y una concentración máxima de biomasa entre
0.7 y 0.8 g.l−1, cosechando en fase de crecimiento exponencial. La biomasa de las microalgas se concentró por centrifugación a 5.000 g durante 15 min y 4 ° C. Para lavar
la biomasa de nutrientes y sales residuales, este procedimiento se repitió 2 veces re-suspendiendo la pasta centrifugada en agua destilada. La evaluación del método
propuesto en este estudio se realizó con la biomasa obtenida inmediatamente después de este procedimiento (en adelante, denominada biomasa fresca). Además, se
produjo biomasa seca liofilizada para el análisis del contenido total de nitrógeno y aminoácidos. Los experimentos se realizaron con suspensiones de biomasa fresca
preparada. Las concentraciones requeridas de las suspensiones, calculadas en una base de peso seco, se ajustaron por dilución de la pasta con soluciones tamponadas a
diferentes pH dependiendo del ensayo. El peso seco de la biomasa se determinó en cada experimento secando en un horno a 105°C durante 24 h mediante el Método
estándar. Los ensayos se realizaron en tubos centrífugos de 2 ml, en una incubadora orbital a 150 rpm, a las temperaturas y los tiempos especificados posteriormente en
función del experimento. La primera extracción alcalina se realizó incubando la suspensión en soluciones tamponadas alcalinas a diferentes valores de pH y 50°C. Al
final de los tiempos de reacción seleccionados, los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación a 10.000 x g para un análisis adicional (extractos alcalinos) y
el sedimento se mantuvo para la reacción enzimática posterior. Este sedimento se re-suspendió inmediatamente en 100 mM de Tris-HCl a pH 8, diluyendo hasta alcanzar
el volumen inicial utilizado en la reacción alcalina. Posteriormente, la reacción enzimática se llevó a cabo incubando con Alcalase a diferentes temperaturas y tiempos,
utilizando una dosis de enzima de 0,2 ml.g-1. Las reacciones se detuvieron inactivando las enzimas a 85°C durante 10 min. Posteriormente, los sobrenadantes se
recuperaron mediante centrifugación a 10.000 x g para un análisis adicional (extractos enzimáticos) y los sedimentos se descartaron. Tanto los extractos alcalinos como
los enzimáticos se congelaron y almacenaron a -20°C hasta su análisis. Las soluciones tamponadas utilizadas en los ensayos consistieron en pH 8 (Tris-HCl 100 mM), pH
10 (Na2CO3 50 mM), pH 11 (Na2CO3 50 mM) y pH 12 (Na2HPO4 50 mM). Estos valores de pH corresponden a los valores finales obtenidos por titulación con NaOH o HCl
a 25°C. Se usó una solución a pH 13.4 en un tratamiento altamente alcalino, obtenido por titulación con NaOH de una solución 50 mM de Na2HPO. Dentro de los métodos
de análisis se realizó la determinación de la proteína total, nitrógeno total y composición de aminoácidos, el contenido de proteína total del consorcio de microalgas se
calculó a partir del nitrógeno total, multiplicado por un factor de conversión de nitrógeno a proteína obtenido del análisis de la composición de aminoácidos,
determinado como se describe a continuación. El factor de conversión de nitrógeno en proteína (k) se calculó de acuerdo con Mosse, como el promedio entre el límite
superior kA y el límite inferior kp. El contenido total de nitrógeno se determinó mediante análisis elemental utilizando el método de combustión Dumas. El análisis de la
composición de los aminoácidos se realizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El amoníaco se determinó por separado mediante cromatografía
iónica con un detector amperométrico de pulso con un electrodo de oro como electrodo de trabajo.
 ANALISIS DE DATOS
• Los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con un nivel de significación del valor de p igual a 0,05, seguido de la
prueba de comparación múltiple de Turkey, cuando corresponda. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado. El contenido total de proteínas del
consorcio de microalgas fue del 39,5% de la biomasa (base en peso seco). Este valor se obtuvo a partir del contenido total de nitrógeno en la biomasa de
8.93%, multiplicado por un factor de conversión de nitrógeno a proteína de 4.43. El factor de conversión está dentro del rango de los valores informados
anteriormente. Se estudió el efecto del pH de la primera reacción alcalina en el proceso secuencial para establecer su valor óptimo y reducir las variables de
estudio de experimentos posteriores, como resultado de este ensayo, se seleccionó el pH 13.4 como el pH óptimo para la reacción alcalina. El alto tratamiento
alcalino realizado demostró ser capaz de extraer proteínas con un alto rendimiento, así como de debilitar la pared celular de las microalgas recalcitrantes para
la extracción enzimática adicional del material proteináceo.

• En nuestro estudio, seleccionamos este tratamiento alcalino muy alto con el objetivo de investigar esta alternativa para maximizar la recuperación de nitrógeno
de microalgas recalcitrantes utilizando biomasa fresca, como medio para obtener un posible recurso de bajo costo de estos bioproductos para muchas
aplicaciones potenciales. Tanto en los modelos de proteína como de FAN, la concentración de la biomasa fue la variable principal que afectó el proceso global.
Sin embargo, en el rendimiento de proteínas, el efecto de la concentración de biomasa fue negativo y en FAN fue positivo, el efecto negativo de la
concentración de biomasa probablemente fue causado por la dilución del medio alcalino por el volumen de biomasa en las concentraciones más altas de
biomasa. En la Tabla 3 se muestra la significación estadística de las variables de los modelos, revelada por sus valores de p. En el modelo de proteínas, todos
los efectos estudiados, así como las interacciones entre la concentración de biomasa con los tiempos de las reacciones tanto alcalinas como enzimáticas,
tuvieron un valor de p inferior a 0,05, lo que indica que sus efectos fueron significativos con un nivel de confianza del 95,0%. Además, el término cuadrático del
tiempo de la reacción alcalina fue significativo. Para FAN, todos los efectos estudiados también fueron significativos y la interacción entre la concentración de
biomasa y el tiempo de la reacción enzimática, así como el término cuadrático de la concentración de biomasa, también fue significativa. En contraste, en el
caso del FAN, los incrementos en la concentración de biomasa inicial tuvieron un efecto positivo porque aumentan la acción de la proteasa como consecuencia
del efecto de una mayor concentración de sustrato en la misma dosis de enzima. Además, el tiempo y la temperatura de la reacción enzimática tuvieron un
efecto significativamente positivo. Cabe señalar que, en este caso, el tiempo de la reacción alcalina tuvo un efecto positivo y significativo, lo que sugiere que la
primera reacción alcalina no solo afecta directamente a la primera extracción sino que también facilita la acción de la proteasa en la segunda. Extracción por
debilitamiento de la pared celular.
CONCLUSIONES
• El presente trabajo otorga un enfoque alternativo para obtener proteínas y aminoácidos a partir de biomasa
fresca de microalgas resistentes con un alto rendimiento. La metodología de superficie de respuesta utilizada
ha revelado los principales efectos de las variables que afectan el proceso secuencial alcalino-enzimático y
la construcción de modelos para predecir la respuesta del método. Las diferentes opciones existentes
identificadas para maximizar no solo las variables de respuesta individualmente, sino también una
combinación diferente de ellas proporcionan una gran versatilidad al método. Se obtiene un rendimiento
máximo de proteína del 80,3% utilizando una concentración de biomasa de 50 mg.ml-1, a expensas del
rendimiento de FAN o la concentración de proteína en el extracto final, siendo el pH óptimo de 13,4 y asi
poder realizar el proceso altamente alcalino y seguidamente el enzimático para obtener un alto rendimiento.

• El primer tratamiento alcalino puede afectar las propiedades de las proteínas por desnaturalización,
racemización y formación de lisinoalanina, lo que podría dificultar el desarrollo de algunas aplicaciones
según el grado de afectación, como las sustancias emulsionantes o espumantes. Los péptidos del extracto
enzimático son especialmente interesantes por sus beneficios, como el uso como moléculas bioactivas,
fertilizantes y medios de cultivo de microorganismos, entre otros.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Richmond, A. (2004). Principios para lograr la máxima productividad de microalgas

en fotobiorreactores: una visión general. Hidrobiologia, 512(1), 33-37.
• Moreno-Galván, A., Rojas-Tapias, D., & Bonilla, R. (2012). Desarrollo y evaluación de un
medio de cultivo alternativo para la multiplicación de Azospirillum brasilense C16
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Agropecuaria, 13(2), 201-206.
• González-Delgado, A. D., Barajas-Solano, A. F., & Ardila-Álvarez, A. M. (2017).
Producción de biomasa y proteínas de Chlorella vulgaris Beyerinck (Chlorellales:
Chlorellaceae) a través del diseño de medios de cultivo selectivos. Corpoica Ciencia
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