Polinucleótidos

Extremo 5’
O
H
N N
H
HOCH2 N
N N
O H

-
O O
P H H
-
N
O
O
N
H 2C
N O
O

-
O O
P O
-
O H 3C H
O N
Enlace H 2C N O
Polinucleótido
fosfodiéster O

-
O O H
H N
P
-
O N
O N

H 2C N N
O

-
O O
P O
- H
O N
O N
H
N
H 2C N N
O H

Extremo 3’ OH
Formas de representación de polinucleótidos

5’- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3’

5’-CATTGCGGAATGCC-3’
3’-GTAACGCCTTACGG-5’
 3’
H O

5’ -
O O H
N
N
O
P O N CH2
- H
O N O
O N O
H O-
N P
H 2C N N
O H O O-

N
-
O O N O
O
H H CH2
P N
-
O N N O
O H O-
N
N P
H 2C H H
N O O O-
O
H N
N O
-
O O N
H CH2
P O
N N
-
O
O
H3C
N
H O
P
O- Polinucleótido
H 2C
O
N O H 3C O O-
en doble hélice
O
-
O O H O
H N N CH2
P N
- H
O N O O
O N O-
P
H 2C N
O
N H O O-
N
-
O O H O
N
O N CH2
P
- H
O N O
O N O
H O-
N P
H 2C N N
O H O O-

3’
O
5’
 Propiedades de los polinucleótidos, 1

1. Absorción de luz UV a 260 nm

Hipocromismo

% A260,
120
En el DNA doble hélice se da el
fenómeno de hipocromismo:

el DNA desnaturalizado por el calor 110

absorbe un 20-30 % más que el
DNA nativo
100
T (ºC)
 Propiedades de los polinucleótidos, 2

2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la

difenilamina y al reactivo de Schiff

3. Reacción positiva de los polirribonucleótidos al orcinol

4. Reacción con agentes intercalantes (acridinas)

5. Hidrólisis completa del RNA con álcali; el DNA es resistente

a álcali.
 Rotura química de polinucleótidos

- Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil sulfato (DMS)

tiene lugar la metilación de purinas; por calentamiento a pH neutro
se rompe el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico; el tra-
tamiento ulterior con ácido diluído rompe la cadena por el sitio
apurínico.

- Tratando un polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el

enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi-
dínico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por
el sitio apirimidínico.
 -
O O H H
-
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N

H 2C N O H2 C N O
O O

-
O O -
O O
P O P O
- H -
O H3 C H
O N
O N N O N
H H
N N
H 2C N H2C N N
N
H H
O O

-
O O -
O O
P O DMS P O
- -
O H3 C H O H3C H
O N O N

H 2C H2C N O
N O
O O

-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O N O N
O N O N

H 2C N H2C N N
N
O O

O O
 -
O O H H -
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N

H 2C N O H2C N O
O O

-
O O -
O O
P O P Sitio apurínico
-
O H3C H -
O
O N N O
H
N
H 2C N N H2C OH
H
O O

-
O O -
O O
P O P O
- -
O H3 C H O H 3C H
O N O N
pH bajo
H 2C N O
Calentamiento H2C N O
O O

-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O N O N
O N O N

H 2C N N H2C N N
O O

O O
 -
O O H H
-
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N

H 2C N O H2 C N O
O O

-
O O -
O O
P P
- -
O Sitio apurínico O
O O-

H 2C OH
O

- O -
O O O-
P O P O
- -
O H3 C H Ácido diluído O H3C H
O N O N

H 2C H 2C N O
N O
O O

-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O O N
O N O N
N

H 2C N H 2C N N
N
O O

O O
Rotura enzimática de polinucleótidos

Endonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en

el interior de una cadena polinucleotídica, y suelen ser
específicas de cada ácido nucleico:

- Ribonucleasas
- Desoxirribonucleasas

Exonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en los

extremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelen
atacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos:

- Exonucleasa de bazo (rotura tipo b)

- Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)
 -
O O
O O
P
- H H
O N N
O N O N
H H
N -
O P O CH2 N
H 2C N N N
N O H
O H O-

OH
-
O O
H H H H
P N N
-
O
O
N
O
N Rotura tipo a:
H 2C -
N O O P O CH2 N O
O O
O-
OH
Da lugar a una
-
O O
P O O mezcla de
5’-nucleótidos
- H3C H
O H3 C H
O N N
O
-
H 2C O P O CH2 N O
N O O
O O-

- O OH H
O H H N
H N
P
-
O N N
O N N
O
- N
H 2C N O P O CH2 N
N O
O O-
O OH
 -
O O
O O
P H
-
O H N
O N N
N H
H
N HOCH2 N
H 2C N N N
N O H
O H

O
-
O O -
O P O H H
P H H N
N -
- O
O
O
N N
H 2C HOCH2
N O
Rotura tipo b:
N O O
O
O
- O
O
P O
-
O P O
O- O
Da lugar a una
-
O
O
H 3C
N
H
H3 C
N
H mezcla de
H 2C
O
N O HOCH2
O
N O 3’-nucleótidos
-
O O H O
H N -
P O P O
-
O H
O N O- H N
N

H 2C N N
N N
O
HOCH2 N
N
O O

O
-
O P O
O-
Endonucleasas:

DNAasa I: rotura completa, tipo a

DNAasa II: rotura completa, tipo b
RNAasa pancreática: rompe (b) enlaces Py-X
RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X

Endonucleasas de restricción

Exonucleasas:

Exonucleasa de bazo: libera 3’-nucleótidos

Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5’-nucleótidos
 Endonucleasas de restricción, 1:

1. Reconocen secuencias específicas, por lo general palindrómicas:

5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’

3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’

La secuencia reconocida en este caso es GAATTC

 Endonucleasas de restricción, 2:

2. Suelen romper el polinucleótido dejando extremos cohesivos:

5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’

3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’

5’- ATCGTTGCCTACAATTG AATTCCCAATAACCCTT -3’

3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAA GGGTTATTGGGAA -5’

Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la

misma endonucleasa de restricción
 Endonucleasas de restricción, 3:

3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA

por un número muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula-
ción experimental del mismo.

Algunas endonucleasas de restricción:

EcoRI GAATTC
ClaI ATCGAT
HaeIII GGCC
RsrII CGGATCCG
 Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa
de restricción EcoRI, que es

5’-GAATTC-3’

En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y

20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar
sería de

0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324

O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos

Separación electroforética
de fragmentos de restricción
del DNA.

Una vez separados, se tratan

con bromuro de etidio (un agen-
te intercalante) y se observan
bajo luz UV.
Método de Sanger para secuenciación de polinucleótidos

1. Sea un DNA que se desea secuenciar:

3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -

2. Disponemos de un oligonucleótido complementario a la secuencia,TAGGCACG que se hibrida

con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva síntesis. Este
oligonucleótido está marcado radioactivamente.
3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACG
5’ 3’
3. La muestra se divide en cuatro partes, que contienen:

A) Los cuatro desoxinucleósido trifosfatos, dATP, dGTP, dCTP, dTTP

B) DNA polimerasa I (fragmento Klenow)

y específicamente cada una,

C) un didesoxinucleósido trifosfato, que al carecer de 3’-OH interrumpe

la síntesis de DNA allá donde se incorpore.

Muestra A Muestra B Muestra C Muestra D

dATP dATP dATP dATP

dGTP dGTP dGTP dGTP
dCTP dCTP dCTP dCTP
dTTP dTTP dTTP dTTP

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP

 Síntesis en presencia de ddGTP
3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAG*
3
5’ 3’

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGG*
4

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCG* 12
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG* 15
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*
21

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*
26
 Síntesis en presencia de ddATP
3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGA*
1
5’ 3’

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - 2
-*TAGGCACGAA*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCA*
6
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACA*
8

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - 13
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGA*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCA*
17
 Síntesis en presencia de ddCTP
3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGC*
5
5’ 3’

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCAC*
7

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTC*
11

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGC*
16

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATC*
20

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATC*
25
 Síntesis en presencia de ddTTP
3’ 5’
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC - 9
-*TAGGCACGAAGGCACAT*
5’ 3’

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATT*
10

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGAT*
14

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAAT*
19

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAAT*
24

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCGAACGT*
31
 G A T C
-
60
A continuación, las cuatro mezclas
se someten a electroforesis en poli-
50
acrilamida-SDS. Este método sepa-
ra polinucleótidos en función de su
tamaño, de forma que los más cortos
40 se desplazan más rápidamente. Como
el cebador está marcado radioactiva-
mente, revelamos la plancha de
30 electroforesis por autorradiografía.

20

Con esto leemos directamente la

secuencia complementaria del poli-
10
nucleótido inicial:

5’-AAGGCACATTCGATGCAAT-
CGAATCGAACGTCCCAAAAG-
GATTCCGGGAAAATG-3’
+