ADN recombinante e

ingeniería genética
ADN recombinante

La tecnología del ADN recombinante permite la identificación y el aislamiento de

genes concretos de entre todos los genes presentes en el genoma. Igualmente
permite la producción de grandes cantidades de este gen en forma de moléculas
clonadas de ADN.
El término ADN recombinante hace referencia a moléculas de ADN producidas por
la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

Denominada con frecuencia ingeniería genética, la tecnología de ADN recombinante

abarca en la actualidad una serie de técnicas moleculares que pueden utilizarse
para analizar, alterar y recombinar casi todas las secuencias de ADN.
Técnicas de ADN recombinante

o Métodos por localizar secuencias específicas de ADN

o Técnicas para cortar el ADN en localizaciones precisas.
o Procedimientos para amplificar una secuencia particular de ADN.
o Métodos para inducir la mutación y la unión de fragmentos de ADN a fin de
producir las secuencias deseadas.
o Procedimientos para transferir secuencias de ADN en las células receptoras.
ADN recombinante
Los procedimientos básicos incluyen los siguientes pasos:

1. Se purifica el ADN a clonar.

2. Se usan enzimas de restricción, las cuales reconocen y cortan las moléculas de
ADN por secuencias nucleotídicas especificas.
3. Los fragmentos obtenidos se unen otras moléculas de ADN que sirven de
vectores (un fragmento de ADN unido a un vector es el ADN recombinante).
4. La molécula de ADN recombinante se transfiere a una célula huésped (en donde
se replicará, produciendo copias idénticas o clones de sí misma).
5. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el ADN
recombinante.
6. El ADN clonado puede recuperarse de las células huésped, purificarse y
analizarse o bien su producto génico puede ser de interés.
 Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción son producidas por las
bacterias como un mecanismo de defensa contra infecciones víricas.

Se unen al ADN y reconocen una secuencia especifica de nucleótidos, denominada

secuencia de reconocimiento. La enzima corta ambas cadenas de ADN dentro de la
secuencia siguiendo un patrón de corte especifico.

Tipo Actividad de ATP Sitio de corte

la enzima requerido
I Corte y Sí Sitios aleatorios distantes del sitio de
metilación reconocimiento (~1,000pb o mas)

II Corte No Dentro del sitio de reconocimiento

III Corte y Sí Sitios aleatorios cerca del sitio de

metilación reconocimiento (~25pb)
Enzimas de restricción
La mayor parte de las secuencias de
reconocimiento son palíndromos.

La mayoría de las enzimas reconocen

una secuencia de 4 ó 6pb.

Algunas realizan cortes alternados y

producen fragmentos con extremos
cohesivos o pegajosos; otras cortan
ambas cadenas en forma recta y
producen fragmentos con extremos
romos.
 Enzimas de
restricción
El ADN purificado se coloca en
un tubo pequeño con una
solución buffer y una cantidad
pequeña de la enzima de
restricción. La mezcla se
calienta a la temperatura
óptima para la enzima, por lo
general 37°C.

El tamaño de los fragmentos

de ADN puede determinarse
mediante electroforesis en gel.
Corte y unión de fragmentos de DNA
 Clonación génica
Para obtener numerosas copias de un fragmento de ADN específico, se coloca el
fragmento en una célula bacteriana y se permite que la célula replique el DNA. Este
procedimiento se denomina clonación génica porque se producen copias idénticas
(clones) de la pieza original de ADN.

Un vector de clonación es una molécula de

DNA replicante y estable a la cual puede
adherirse un fragmento de DNA extraño
para la introducción en una célula. Los
vectores que transportan un fragmento
insertado se denominan vectores
recombinantes.
 Vectores plasmídicos
Los plásmidos son moléculas de DNA circulares que
existen naturalmente en las bacterias. Contienen
orígenes de replicación y por eso pueden replicarse de
manera independiente del cromosoma bacteriano.
 Bacteriófago lambda (λ)

Pueden transportar insertos de

hasta 20kb, más del doble que los
vectores plasmídicos.
Vectores cósmidos Vectores de expresión
Transportan casi 50kb de Están diseñados para producir
ADN insertado. muchas copias de una proteína
seleccionada en una célula
huésped.
 Cromosomas artificiales de
levadura (YAC)

Permiten clonar insertos de 100 a

1,000kb.

Se pueden usar vectores para

transferir ADN a células eucariotas.
Cuando el vector es un plásmido, la
transferencia de ADN se denomina
transformación, y cuando es un
virus transfección.
 Células huésped de mamífero
Para producir animales transgénicos se
usa la transferencia de genes en ovocitos
fecundados.
Los YAC pueden transferirse por
microinyección de ADN en el núcleo de
un ovocito de ratón. Los zigotos
transgénicos se transfieren al útero de
madres adoptivas para que se
desarrollen.

o Los animales (o plantas) que contienen un gen exógeno se denominan transgénicos.

o La PCR elimina la necesidad de células huésped para clonar ADN.
o Una colección de clones que contiene todos los fragmentos de DNA provenientes de
una fuente se denomina genoteca.
Secuenciación de ADN
Método desarrollado por James Sanger

Los dideoxidonucleótidos tienen un

grupo 3’-H en lugar de uno 3’-OH.

La ADN polimerasa inserta un ddATP

en lugar de un dATP, deteniendo la
síntesis.

La secuencia de nucleótidos se lee

desde la base hasta la parte superior
del gel, lo que corresponde a la
secuencia 5’-3’ de la cadena de ADN
complementaria al molde.
 Secuenciación de ADN

En proyectos de secuenciación, cada uno

de los dideoxidonucleótidos se marca con
un colorante fluorescente de diferente
color.

Se añaden los 4 dideoxidonucleótidos a

un mismo tubo y los productos se cargan
en un carril de un gel. El gel es rastreado
por un laser, lo que hace que cada banda
emita fluorescencia de un color.
Secuenciación de ADN

La máquina de
secuenciación tiene
un detector que lee el
color de cada banda y
lo representa en
forma de picos
coloreados.
Ratones con desactivación génica (“knockout”)
Terapia Génica
 En principio existen tres formas de tratar
Terapia génica enfermedades con estas terapias:

• Sustituir genes alterados.

• Inhibir o contrarrestar efectos dañinos.
• La terapia génica se ha desarrollado • Insertar genes nuevos.
como un método de acercamiento al
tratamiento de las enfermedades
humanas basado en la transferencia de
material genético a las células de un
individuo.
• consiste en manipular la información
genética de células enfermas para
corregir un defecto genético o para
dotar a las células de una nueva
función que les permita superar una
alteración.
 Terapia génica

• Los genes son los ladrillos de la herencia. Pasan de

padres a hijos y contienen las instrucciones para
producir proteínas. Si los genes no producen las
proteínas correctas o no lo hacen correctamente, un
niño puede tener un trastorno genético.

• La terapia génica consiste en la inserción de genes

funcionales ausentes en el genoma de un individuo.

• Se realiza en las células y tejidos con el objetivo de

tratar una enfermedad o realizar un marcaje.
• La técnica todavía está en desarrollo, motivo por el cual su aplicación
se lleva principalmente a cabo dentro de ensayos clínicos controlados,
y para el tratamiento de enfermedades severas o bien de tipo
hereditario o adquirido.

• Al principio se planteó sólo para el tratamiento de enfermedades

genéticas, pero hoy en día se plantea ya para casi cualquier
enfermedad.
 Generalidades

• Aunque se han utilizado enfoques muy distintos, en la mayoría de los estudios

de terapia génica, una copia del gen funcional se inserta en el genoma para
compensar el defectivo.

• Si ésta copia simplemente se introduce en el huésped, se trata de terapia

génica de adición.

• Si tratamos, por medio de la recombinación homóloga, de eliminar la copia

defectiva y cambiarla por la funcional, se trata de terapia de sustitución.
• Actualmente, el tipo más común de vectores utilizados son los virus, que
pueden ser genéticamente alterados para dejar de ser patógenos y portar
genes de otros organismos. No obstante, existen otros tipos de vectores de
origen no vírico que también han sido utilizados para ello.

• Así mismo, el ADN puede ser introducido en el paciente mediante métodos

físicos (no biológicos) como electroporación, biobalística,etc.
Características de vectores

Actualmente uno de los medios mas utilizados para la terapia génica es la

utilización de vectores. Usualmente se utilizan virus porque son los que tienen las
mejores características para esta tarea.
Las características que debe tener todo vector que se utilice para la terapia génica
son:
o Que sea reproducible.
o Que sea estable.
o Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño.
o Que permita la transducción tanto en células en división como en aquellas que no
están proliferando.
o Que posibilite la integración del gen terapéutico en un sitio específico del genoma.
 Características de vectores

o Que se integre una vez por célula, para poder controlar la dosis.
o Que reconozca y actúe sobre células específicas.
o Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada.
o Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
o Que pueda ser caracterizado completamente.
o Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mínimos.
o Que sea fácil de producir y almacenar.
o Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable
Vectores Vectores
Para que la terapia génica funcione se
debe introducir el gen terapéutico en cientos
de millones de células, y para ello es
necesario un vehículo o vector que lo
trasporte hasta el interior de las células.
Un buen vector al menos debe:
Vectores virales Vectores no virales
• Ser reproducible y estable.
• Permitir la inserción de material genético.
• Reconocer y actuar sobre
células específicas.
• Poder regular la expresión Existen también vectores
del gen terapéutico. Agrupan cuatro tipos de no virales, como el
virus: retrovirus, bombardeo con
• Carecer de elementos que induzcan adenovirus, virus partículas, la inyección
una respuesta inmune. adenoasociados y directa de ADN, los
• Ser inocuo o que sus posibles efectos herpesvirus. liposomas catiónicos y la
secundarios sean mínimos. transferencia de genes
mediante receptores.
 Enfermedades tratadas con terapia génica

o Hemofilia
o Fibrosis quística
o Distrofia muscular Duchenne
o Alteraciones hepáticas
o Diabetes
o Enfermedades neurodegenerativas
o Ceguera
o Sida
o Insuficiencia cardiaca
o Arterosclerosis
 Enfermedades tratadas con terapia génica

Tratamientos en
que se utiliza la
terapia génica
 En esta terapia se tiene que considerar
algunos factores

o Es necesario saber cuál es “tejido diana”, es decir,

el que va a recibir la terapia.
o Conocer si es posible tratar in situ el tejido
afectado.
o Cual es el vector adecuado que servirá
para introducir el gen en el tejido.
o Cual es la eficacia del gen nuevo y saber qué
respuesta tendrá el órgano o tejido «hospedador»,
con la entrada del gen modificado.
 Terapia génica
germinal y somática
Hay dos tipos principales de terapia génica
que incluyen:
• Con este formulario de la terapia, solamente las células somáticas
(células de cuerpo) se apuntan y no las células del germlines, si no

Terapia se saben como de los gametos o de las células de sexo. Si la

modificación de la DNA se linda a las células de cuerpo solamente,
después el genoma alterado efectúa solamente al individuo tratado
somática y no ningún descendiente produjo cuando los gametos ensamblan
para formar un zygote.

• Esto implica la incorporación de un gen adaptado

Terapia en los gametos, alterando permanente los genes
heredados por las futuras generaciones. Este
Germinal tipo de terapia se prohíbe en muchos países
debido a las preocupaciones éticas y técnicas.
Terapia génica somática
Aquella dirigida a modificar
la dotación genética de células no
germinales.
Toda corrección de un
daño genético a nivel
celular, que no implica
células reproductivas
(espermatozoides y ovulo)
Se centra principalmente en
enfermedades hereditarias
bien definidas cuyo defecto
genético reside en un único
gen, las llamadas
enfermedades monogénicas.
 Terapia génica germinal
Se usaría
Aquella dirigida principalmente para la
a modificar la dotación corrección de
genética de las células enfermedades
implicadas en la formación de congénitas
óvulos y espermatozoides hereditarias.
y, por tanto, transmisible a la
descendencia.

Este tipo de terapia

todavía no se practica en
humanos, puesto que la
alteración de las células
reproductivas va en contra
de la ética.
Terapia génica “in vitro”,
“in vivo”, “in situ” y
antisentido
 Terapia génica in vitro

• Comprende todos aquellos protocolos en los que

las células a tratar son extraídas del paciente,
aisladas, crecidas en cultivo y sometidas al
proceso de transferencia in vitro.
• Una vez que se han seleccionado las células que
han sido efectivamente transducidas, se expanden
en cultivo y se introducen de nuevo en el paciente.

Terapia génica ex vivo

 Permite la Son la mayor
elección del tipo complejidad y
de célula a coste, así como
tratar, mantener la imposibilidad
un estrecho de transducir
control sobre aquellos tejidos
todo el proceso, que no son
y la mayor susceptibles de
eficacia de la crecer en
transducción cultivo; así
genética. como posible
contaminación.
Terapia “In vivo”
ADN introducido directamente a través de la sangre

Agrupa técnicas en las que el material genético se introduce directamente en

las células del organismo, sin que se produzca su extracción ni manipulación
in vitro.

La gran ventaja de las técnicas in vivo sobre la terapia génica in vitro es su

mayor sencillez.

Tienen el inconveniente de que el grado de control sobre todo el proceso de

transferencia es menor, así como también la eficiencia global (dado que no
pueden amplificarse las células transducidas) y es difícil conseguir un alto
grado de especificidad tisular.
Terapia in situ

• Es aquella que se da cuando la

modificación genética de las células
del paciente se realiza introduciendo
el ADN (los genes terapéuticos)
directamente en el propio órgano
defectuoso del individuo.

La distrofia
La
muscular La fibrosis
supresión
de quística
de tumores
Duchenne

ADN introducido a un órgano o tumor

 Terapia antisentido
El término antisentido se aplica a secuencias
cortas de ADN o ARN (oligonucleótidos)
diseñadas para ser complementarias de
secuencias génicas específicas, con el fin de
interferir el flujo de información genética.
Los agentes terapéuticos antisentido inhiben la
síntesis proteica al interferir los procesos de
transcripción y/o traducción.
Existen tres clases principales:

Secuencias Secuencias
Ribozimas
antisentido antígen
 Alcances de la
Farmacogenómica y
Farmacogenética
 Es el estudio de la respuesta
farmacológica del individuo según el
Se encarga de comprender las bases genéticas de genotipo.
la enfermedad y así poder definir nuevas dianas
terapéuticas o marcadores moleculares que
evalúen la eficacia de nuevos fármacos.

Permitiría identificar aquellos fármacos y

dosificaciones de los mismos para los
cuales el paciente desarrolla una
respuesta óptima.
Su objetivo final es conseguir nuevos y efectivos
fármacos para las enfermedades comunes que
carecen de tratamiento adecuado en la actualidad
• La farmacogenómica intenta definir si la expresión del gen relacionado con la eficacia de
una droga afecta a una enzima que interviene en el metabolismo (CYP450,
Nacetiltransferasa, tiopurin metiltransferasa)

POR EJEMPLO:
se estima que una dosis diaria de 10 a 20 miligramos de
nortriptilina es suficiente para un paciente con un sistema CYP2D6
pobre, en cambio un metabolizador uLtra rápido requiere una dosis
de 500mg/día.

• Las diferencias farmacogenéticas y farmacoétnicas pueden alertar a los médicos

acerca de las opciones terapéuticas, dosis y vigilancia de determinados pacientes
ALCANCES
Ensayos de predicción de
efectos secundarios o toxicidad
Identificación de nuevos
pacientes
Descubrimiento y desarrollo de
nuevos fármacos
Permiten identificar pacientes con
predisposición a experimentar efectos
secundarios derivados del tratamiento
con determinados fármacos.
Identifican pacientes que aparentemente
no son adecuados para ser tratados con
el fármaco, pero que potencialmente
podrían responder a él mediante un
reajuste de la dosificación o de la
formulación.
Las aplicaciones clínicas de
farmacogenómica se producen actualmente
la
en las etapas más tempranas del desarrollo
clínico de un fármaco
Bioética en la terapia
genética
Bioética en la terapia génica somatica

La eficacia clínica no ha sido

todavía demostrada;
Infección por el vector viral, inducción de
a pesar de los numerosos
cáncer por inserción en un gen supresor de
protocolos
tumores o por activar un oncogen, interrupción
ya realizados se pueden
de un gen normal con consecuencias
producir daños
negativas como inducir otra enfermedad,
irreversibles. No todos los
Riesgos contaminación bacteriana, respuesta
tratamientos con
inmunológica con reacción
terapia génica han sido
inflamatoria y sólo parcial corrección de
exitosos, se ha visto
la enfermedad genética convirtiendo una
que hay riesgos.
condición fatal en una crónica progresiva
 Bioética en la terapia génica germinal
La terapia génica germinal es
una de las técnicas que es mal
La terapia génica germinal no es vista desde el lado ético,
Launa
terapia génica
técnica germinal
segura comono para
es una debido a que se pone en
técnica seguraen
realizarla como para realizarla
la actualidad. Un en contra la con los derechos que
la actualidad.
problema es el Unconsentimiento
problema es el tiene el bebe y si esta técnica
consentimiento
informado. informado.
La pregunta esLa si no daña al mismo.
preguntaderecho
tenemos es si tenemos derecho
a decidir por lasa
decidir por las generaciones
generaciones futuras. Se futuras.
ha
Seobjetado
ha objetado
queque la terapia
la terapia génica
génica
germinalviola
germinal viola la
la dignidad
dignidad humana
humana
porque cambia
porque el contenido
cambia genético
el contenido
de las siguientes
genético de lasgeneraciones
siguientescuyo
consentimiento
generaciones cuyono puede ser
consentimiento
obtenido
no puede y cuyo interés es ydifícil
ser obtenido cuyode
interés es dilucida
difícil de dilucida
Referencias

o Klug, W.; Cummings, M.; Spencer, C. Conceptos de genética, 8ª ed.; Pearson

Educación: España, 2006; pp. 530-555.

o Pierce, B. Genética: Un enfoque conceptual, 2ª ed.; Editorial Médica

Panamericana: España, 2006; pp. 511-536.

o Consultado en noviembre del 2016

http://www.sefh.es/bibliotecavirtual/fhtomo2/CAP06.pdf (en línea)