UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

CURSO DE MEDICINA
INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR
PROF. DR. FERNANDO AÉCIO

Northern Blot André

Bárbara
Fábio
Pedro
Rebeca
Introdução
● Northern Blot é uma técnica usada na
pesquisa em biologia molecular para
estudar a expressão gênica;
● Consiste em medir o nível de expressão
gênica em um RNAm específico e o
quantificar.
● O nome deriva da similaridade existente
entre ela e o de Southern Blot;
○ distinção na chave
○ formaldeído no gel de agarose
● A sonda hibridizadora pode ser tanto de
DNA quanto de RNA.
Curiosidades...
Anteriormente, em certas ocasiões
era utilizada a técnica de Northern
Blot reverso. Nesse procedimento, o
ácido nucléico (que era fixado à
membrana) era uma coleção de
fragmentos de DNA isolados, e a
sonda era RNA extraído de um tecido
e marcado radioativamente
Utilidade
● Determinar quais tecidos expressam um gene em particular;
● Quais fatores regulam a expressão de um gene – sendo eles nutricionais,
hormonais ou ambientais;
● Obs.: para finalidade
nutricional, está em
crescimento a utilização do
protocolo não radioativo:
quimiluminescência no
Northern Blot.

Agarose gel electrophoresis of total RNA

Utilidade
● Comparação de tecidos normais com tecidos
cancerígenos;
● Permite ativar os oncogenes para mostrar a
sua expressão e também a baixa regulação
dos genes supressores tumorais;
● Permite observar um padrão da expressão
gênica nos estágios de desenvolvimento do
CA, níveis de estresse ambiental ou infecção
por patógenos ao longo do tratamento.
PROTOCOLOS PARA O NORTHERN BLOT:
Para a realização da técnica com eficácia é necessário seguir 08 etapas:

Etapa 1: Há a extração do RNA total de um tecido a partir do DNA coletado.

Para se ter a molécula de fita simples é necessário usar moléculas capazes de

romper as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas em
macromoléculas, exemplo: isotiocianato de guanidínio.

Etapa 2: Há o isolamento do RNAm do RNA total dando maior sensibilidade .

A separação ocorre pela adição da cauda poli-A que envolve a coluna de

nucleotídeos de timina (oligoT), que facilitou a ligação da cauda poli-A ao
RNAm,quando adicionada há a síntese nas extremidades 3’ OH livre.
Etapa 3: O RNA extraído , são separados de acordo com o tamanho molecular
por eletroforese em gel de agarose.

O DNA em meio neutro ou básico tem carga negativa.

As moléculas maiores migram lentamente e as menores migram rapidamente

.

Os agentes desnaturantes no gel são de uso obrigatório.

Em geral, o formaldeído é usado

Não ocorre pareamento entre bases.

ETAPA 4:
Ocorre o blotting(borrão) na membrana de nylon.

O borrão pode ser a vácuo e capilar.

Macromoléculas são atraídas para o polo positivo

RNA é imobilizado.
ETAPA 5:
O RNA é imobilizado na membrana.

Essa ligação é resultado da ligação covalente do RNA para a membrana.

Ligação covalente do RNA para a membrana impede que o ácido nucleico seja
lavado durante o processamento.
ETAPA 6:
A sonda de hibridização é preparada.

Há o pareamento das bases com a sonda marcada por radisiótopo ou corante

fluorescente .

Existem duas formas de hibridização : DNA complementar(cDNA) ou

oligonucleotídeos anti-sentido.

É o método mais usado no Northern Blot.

O cDNA está mais propenso a ter discriminação por RNAses.

ETAPA 7:
A sonda hibridiza com a membrana de nylon, depois há a pós-hibridização.

A sonda está ligada especificamente ao RNAm alvo e está ligada

insignificantemente aos outros RNAm.
ETAPA 8:
Há a detecção da hibridização .

Sinais são detectados por raio X e quantificados por densitometria.

Essa quantificação é baseada em unidades arbitrárias e mudanças relativas

entre gurpos experimentais e de controle.

Detecção de sondas com ou sem radioatividade .

Essas enzimas são conjugadas a uma sonda ou marcadas por um ligante.

Diagoxigenina
NORTHEN BLOT PARA USO NUTRICIONAL:

Há desvantagens em usar os radioisótopos , por isso há uma crescente

utilização da quimiluminescência no Northern Blot.

Essa técnica tem sido usada para identificar genes específicos de doenças.
Demonstração da técnica:
Aplicações Biomédicas (1)
A elucidação do processo de foliculogênese

1. Melhor aproveitamento do potencial biológico do ovário

1. Compreender a função dos diferentes hormônios e fatores de

crescimento que atuam na regulação da fisiologia ovariana

1. Técnicas de cultivo in vitro à quantificação e à identificação do local de

produção de cada substância envolvida nas diferentes etapas do
desenvolvimento folicular
A análise da expressão gênica tem adquirido importância em muitos campos de pesquisa biológica

1. Fornecer um melhor entendimento dos complexos sistemas regulatórios;

1. Identificação de genes relevantes para novos processos biológicos ou

implicados em doenças.
Aplicações biomédicas (2)
“Fortune, 2003 afirma que:

“A elucidação dos mecanismos que regulam a foliculogênese inicial é o

pré-requisito básico para o uso de folículos pré-antrais no melhoramento
da eficiência reprodutiva em animais domésticos, em humanos com
problemas de fertilidade e em espécies ameaçadas de extinção”.
1. A localização de proteínas, RNAm e seus receptores auxilia a
compreensão do papel de cada hormônio e fator de crescimento em
cada fase do desenvolvimento folicular, uma vez que possibilita
identificar a localização e o quanto cada uma das substâncias presentes
no ovário estão sendo produzidas.
2. Muitas Mutações são refletidas na alteração dos padrões da expressão
gênica;
Tecnologia aplicada na detecção de marcadores
tumorais
1. O Northern blotting é freqüentemente usado para estudos de expressão
gênica;
2. mRNA é indicativo de expressão de determinada proteína – por exemplo,
para determinar se RNAs específicos estão presentes em diferentes tipos
de células.
Técnica de microarranjos
1. Baseia na quantificação dos RNAm produzidos pela célula (produtos de
expressão gênica);
2. Fornece uma poderosa plataforma de análise do padrão de expressão de
milhares de genes simultaneamente;
3. Possibilita a comparação entre diferentes amostras, podendo ser estas
representativas de diferentes estádios do desenvolvimento, diferentes
tipos celulares ou histológicos, diferentes sensibilidades a drogas ou entre
tecidos normais e patológicos
Técnica de Microarranjos - Aplicações
1. As aplicações desta técnica são amplas, variando desde a análise de
patologias como câncer;
2. Estudo de efeito de fármacos ;
3. Análise de tecidos submetidos à determinada condição de estress.
 VANTAGENS
- Técnica relativamente barata e de fácil aplicação
- Estudo de diferentes tecidos do mesmo organismo
- Estudo do padrão temporal de expressão de genes
durante o crescimento do indivíduo
- Identificar se determinado gene é transcrito em RNA
 DESVANTAGENS
A análise de Northern blotting é muito sensível a
degradações leves de RNA. Por esse motivo, é importante
usar luvas durante todas as manipulações

RNAses são praticamente onipresentes e estão presentes

principalmente em nós mesmos: a nossa pele, cabelos,
unhas, saliva, etc. Por isso, ao manipular não só as
amostras de RNA, mas tudo o que for entrar em contato
com elas, deve se ter uma série de cuidados
Uma precaução simples é reservar equipamentos para o
trabalho de RNA livre de RNAses.

Deve-se ter, de preferência, uma amostra pura e livre de

DNA