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Définitions de l’anatomie pathologique

•L’anatomie pathologique (ou anatomo-pathologie) est la


discipline médicale qui permet la reconnaissance des
anomalies des cellules et des tissus d’un organisme,

• appelées lésions, pour effectuer le diagnostic des maladies,


porter un pronostic et, plus généralement, en comprendre les
causes et les mécanismes.
•Elle s’appuie sur des techniques morphologiques (c'est
à dire l'analyse de la forme des objets) :
• examen macroscopique (à l’oeil nu) et microscopique
photonique (dit aussi « optique ») et électronique,
•immunohistochimie, hybridation in situ, parfois
quantifiées (morphométrie) et sur d’autres méthodes
utilisées parallèlement (PCR sur coupes ou cellules
isolées, microbiologie...).
•Elle nécessite une collaboration étroite entre
l’anatomo-pathologiste, le biologiste, l’imageur et le
clinicien (corrélation anatomo-clinique).
•Lésion Toute altération morphologique qui constitue la cause ou la
conséquence d’un processus pathologique
•La lésion est une altération morphologique. Elle peut être la cause ou la
conséquence d’un processus pathologique. Les modifications
fonctionnelles ou morphologiques normales
ne sont donc pas des lésions.
•On distingue les lésions élémentaires (altérations morphologiques
d’une structure isolée, par exemple une cellule, un organite cellulaire, le
tissu interstitiel) et les ensembles ou syndromes lésionnels (association
de lésions élémentaires permettant de formuler un diagnostic et de
porter un pronostic).
• L'association et l'enchaînement des différentes lésions élémentaires réalisent les
ensembles (ou groupements) lésionnels qui constituent l'image pathologique
analysée par l'anatomo-pathologiste.
•Les différentes familles de lésions permettent de reconnaître les principales
variétés de processus pathologiques :

•malformations, phénomènes immunitaires et inflammatoires (qu’ils soient ou


non d’origine infectieuse),troubles circulatoires, phénomènes dégénératifs (qu’ils
soient d’origine génétique ou acquis) et les tumeurs.
Etape N°1 - Réception
•L'échantillon est reçu par le service de
réception du laboratoire.
•Après vérification de la conformité,
• il est enregistré dans la base de données et un
numéro de traçabilité lui est alors attribué.
Etape N°2 - Prélèvement

• on distingue quatre catégories majeures de prélèvement :


• les frottis (ou grattage),
• les biopsies (fragments de tissu ou d’organe), les organes
en intégralité
• et les liquides d'épanchement divers (pleural, sciatique,
péricardique, etc.).
• Il existe également des techniques de prélèvement plus
sophistiquées : par excision, ponction ou microdissection.
LES PRELEVEMENTS
Les prélèvements cytologiques

Les cellules isolées peuvent être obtenus de diverses façons :

• Recueil des liquide spontanément émis (urine, expectoration, fistule…)

• Raclage, brossage, écouvillonnage, aspiration de cellules (col utérin, bulle

cutanéo-muqueuse, bronches, voies biliaires, aspiration après lavage

bronchoalvéolaire)
• Ponction à l’aiguille d’un liquide (épanchement de séreuse ou articulaire, liquide

céphalorachidien, kystes,…)

• • Ponction à l’aiguille d’un organe ou d’une tumeur (ganglion, nodule thyroïdien

ou mammaire,…)

• • Apposition d’un organe (pièce opératoire, biopsie) sur une lame


Procédure de ponction in vivo : A) mise en place de l'aiguille
coaxiale, B) pistolet à biopsie introduit dans l'aiguille coaxiale,
C) tatouage
Prélèvement Tissulaire
• Le matériel est prélevé de différentes façons :

• Biopsie (directe comme pour la peau, le muscle ou avec endoscopie pour


les organes des appareils respiratoire, digestif, urinaire).

• Ponction à l’aiguille (comme pour le liquide pleural, péritonéal,


articulaire, pour les ganglions, les seins, la moelle osseuse).

• D’une pièce opératoire

• D’une autopsie

• Ou de la dissection d’organe en expérimentation animale.


• Enregistrement

• Lorsqu'un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro

d’identification unique qui sera retranscrit sur les blocs et les lames qui seront

examinées au microscope après le traitement technique du prélèvement.

• Chaque prélèvement doit être accompagné d'une fiche de renseignements remplie

par le médecin prescripteur qui doit mentionner :

• • l'identité du patient : nom, prénom, date de naissance, sexe. • le siège, la date (jour

et heure) et la nature du prélèvement (biopsie ou exérèse).


• les circonstances cliniques et para cliniques qui ont motivé le
prélèvement,

• • L'aspect macroscopique ou endoscopique des lésions (un compte-rendu


opératoire peut être utilement joint) ; éventuellement l'aspect d'imagerie,
en particulier pour les tumeurs osseuses.

• • les antécédents pathologiques du patient, les antécédents d’examens


anatomopathologiques effectués dans un autre laboratoire. La nature des
traitements éventuellement administrés au malade.

• • le nom et coordonnées du médecin prescripteur et du prélveur


Biopsie

• - Prélèvement d’un fragment tissulaire effectué sur le malade permettant de


vérifier un diagnostic donné après analyse au microscope.

• - Une biopsie est un prélèvement d'un échantillon de tissus de l'organisme effectué


afin de procéder à un examen, microscopique le plus souvent, ou, parfois,
biochimique, immunologique, génétique ou bien bactériologique.
• Lorsqu’une biopsie est obtenue à l’aide
• d’une aiguille, l’échantillonnage dépend
• de la conception de l'aiguille et de
• l'énergie de son insertion dans le tissu.
• L'aiguille utilisée est un tube creux avec
• une pointe capable de perforer les tissus.
• Comme l'aiguille s’enfonce

• dans le tissu, ce dernier va

• s’accumuler dans le tube creux.

• Lorsque l'aiguille est retirée du

• tissu, l’échantillon reste dans le

• tube et l'aiguille peut être

• récupérée pour l’analyse.


La valeur des biopsies repose sur :• leur taille (exemple : pour la recherche d’une

artérite de Horton où les lésions sont segmentaires,

une biopsie d'artère temporale représentative doit mesurer au moins 1,5 cm)

• leur nombre : plus elles sont nombreuses, plus on a de chance de trouver du tissu

tumoral, de rendre compte de l'hétérogénéité d'une tumeur, d'observer une lésion

focale mais importante pour le diagnostic


• • le choix de la zone biopsiée : éviter les zones nécrotiques ou hémorragiques
; sur la peau ou une muqueuse éviter les prélèvements trop superficiels ;
biopsier le ganglion ayant fait l'objet d'une ponction cytologique motivant la
biopsie ...

• • la bonne préservation des tissus : ne pas étirer ou écraser les fragments,


éviter le bistouri électrique "grillant" les tissus

• • le repérage topographique de biopsies multiples (flacons différents


répertoriés).
• L'autopsie

• (ou nécropsie) correspond à l'examen anatomo-pathologique pratiqué sur un


cadavre.

• Les autopsies médicales sont distinctes des dissections anatomiques qui sont
pratiquées dans les Laboratoires d'Anatomie pour l'enseignement des
étudiants en anatomie et pour la recherche,
• Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice (réquisition du
procureur ou ordonance d’un juge d’instruction).

• Elles les ont habituellement par un médecin expert inscrit sur les listes de la Cour d’Appel,
mais tout médecin peut être désigné.

• Il n’existe pas de réelles exigences de compétences techniques.

• Les autopsies sont pratiquées dans tous les cas de mort suspecte, notamment lorsqu’il n’y a
pas eu délivrance de permis d’inhumer (cf case « obstacle médico-légal » sur les certificats
de décès.

• Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement par les
médecins anatomo-pathologistes, à la demande des médecins qui ont soigné le patient
pendant son séjour à l'hôpital, éventuellement à la demande d'un médecin traitant pour un
patient décédé à son domicile.NON
• pièce opératoire Etude macroscopique

• Les pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d'un ou de


plusieurs organes, séparés ou en monobloc.

• L'examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de


l'étude d'une pièce opératoire : la pièce est examinée, mesurée .
pesée, palpée puis disséquée. Ces constatations sont confrontées aux
documents cliniques et/ou radiologiques d’où l’importance des
renseignements écrits fournis par le médecin clinicien.
• L'examen macroscopique donne des indications pour le pronostic de la
maladie (notamment taille et localisation d’un cancer)

• et il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l'étude


microscopique : zones lésées, zones d'aspect macroscopique sain et limites
d'exérèse
• I) Techniques d’étude des cellules
• 1) Etalement des cellules sur des lames de verre : l'étalement est fait par le préleveur lors
des cytoponctions d'organes, des frottis, écouvillonage, brossages ou appositions ; ce
• geste simple doit être bien maîtrisé pour
• éviter un écrasement des cellules ou des
• amas en plusieurs couches peu interprétables
• 2) Etalement des cellules en monocouche

• Cette technique moins répandue consiste à recueillir les cellules par ponction
(séreuse, organe plein,…) ou frottis (col utérin) et à les transmettre au
laboratoire dans un liquide conservateur.

• Les cellules présentes dans le flacon de fixateur sont ensuite remises en


suspension (Vortex) et éventuellement soumises à une dispersion par gradient
de densité, puis s'effectue un processus de concentration (par filtration et/ou
centrifugation).

• Enfin, les cellules sont transférées en couche mince sur une lame, sur une
pastille de taille déterminée.
• 3) Cytocentrifugation sur lame de
verre

• Le liquide (naturel, ou
d’épanchement, ou de lavage)

• est acheminé au laboratoire où il est


centrifugé

• directement sur une lame de verre,

• sous forme de pastille


• La fixation des étalements se fait soit par

simple séchage à l'air pour la coloration de

Produit de cytoponction d’un ganglion lymphatique de


May- Grunwald-Giemsa , lymphome de Hodgkin ;
étalement coloré au May-Grünwald-Giemsa
• soit par immersion dans l'alcool-ether

• ou par application d'un aérosol de laque

fixante, pour les colorations de Harris-

Schorr ou de Papanicolaou (frottis Frottis cervico-utérin :


étalement coloré au
Papanicolaou
cervicoutérins.
Inconvignants

• Un examen cytopathologique fournit des renseignements souvent partiels,


voire sans certitude.

• Par exemple, les anomalies cytoplasmiques et nucléaires observées dans des


cellules cancéreuses, peuvent être difficiles à distinguer de modifications
cellulaires induites par des phénomènes inflammatoires ou régénératifs.

• Un contrôle par biopsie peut être nécessaire avant toute thérapeutique.


• Techniques d’étude des tissus
• La technique de base comporte plusieurs étapes : la fixation, l’inclusion en
paraffine, la confection des coupes et leur coloration.
3. Fixation :
• La fixation a pour buts la conservation des structures et le
durcissement des tissus.
• c’est l’action de tuer les cellules, de manière à conserver les
structures dans un état morphologique aussi proche que
possible de l’état vivant.
• On peut fixer à l’aide de procédés chimiques (alcool, formol,
acide acétique, ...)
• ou bien par des procédés physiques, comme la congélation
brusque.
• Indispensable pour conserver la morphologie

cellulaire,

• elle doit être immédiate ou au moins très

rapidement débutée après l'obtention du

prélèvement.

• Toute fixation défectueuse rend l'étude anatomo-

pathologique difficile voire impossible (dessiccation

et/ou autolyse du tissu).


•Les liquides fixateurs les plus utilisés sont le formol 10% tamponné et le
liquide de BOUINS (formol +acide picrique).

• Pour les biopsies de petite taille, des fixateurs à base d'alcool peuvent
être utilisés

• fixation encore plus rapide mais effet délétère sur certains antigènes ce
qui peut nuire à des techniques particulières d’immunohistochimie).
• Le protocole de fixation dépend de la technique utilisée :
Microscopie photonique, Microscopie életronique à
transmission (MET), Microscopie électronique à balayage
(MEB).

Fixateurs coagulants: solvants organiques = Méthanol,


Ethanol, Acétone. Ces agents retirent l'eau mais induisent
des remaniements de structure modifiants la polarité des
molécules. Par contre ils conservent les activités
enzymatiques.
Fixateurs additifs: Formol, glutaraldéhyde, acide picrique,
tétraoxyde d'osmium.. Bcp plus utilisés.
• Au cours de la fixation Trois précautions doivent être prises :

• 1) le volume du fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce.

• 2) Le récipient doit être de taille suffisamment grande pour prévenir les


déformations des pièces opératoires volumineuses.
3)Avant fixation, les organes creux (tube digestif, vésicule biliaire, utérus..) doivent
être ouverts et si nécessaire lavés de leur contenu afin de prévenir l'autolyse des
muqueuses ; les organes pleins volumineux (foie, rate) doivent être coupés en
tranches pour faciliter la pénétration rapide et homogène du fixateur ;

• les poumons peuvent être fixés par insufflation d’une solution de formol dans les
bronches ou coupés en tranches.

• Seuls les cerveaux de nécropsies seront plongés dans une solution de formol
sans être tranchés en raison de la fragilité de la substance cérébrale.
• La durée de la fixation dépend de la taille du prélèvement : au minimum 2
à 5 heures pour une biopsie et 48 heures pour une pièce opératoire.

• Les prélèvements calcifiés (os, certaines tumeurs) doivent être sciés, puis
fixés, puis plongés dans une solution décalcifiante (acide) avant d'être
inclus dans la paraffine, ce qui rallonge la durée de la technique.
Fixation par des méthodes physiques

1. La dessication est une méthode trés simple. Elle consiste a laisser I’eau
s’ évaporer a l’air libre et a température ambiante.

2. La sublimation consiste a faire évaporer la glace. Elle suppose d’abord


une transformation de l’eau en glace par congélation, ensuite une
sublimation de la glace.

3. Il existe une troisième possibilité qui consiste a remplacer l’eau par un


solvant miscible a I’eau : alcool éthilique, méthilique, ou l’acétone. Cette
technique s’appelle la déshydratation.
• Les fixateurs chimique les plus répondus

• Formol: en forme liquide conserve assez bien les systèmes enzymatiques.

• Formaldéhyde = fixateur de pénétration / réaction rapides. Réaction réversible

par ajout d'eau.

• Glutaraldéhyde: polymérise pour donner des produits dérivés. A préparer

extemporanément. Réaction irréversible. Il pénètre peu et lentement ce qui fixe

très bien les tissus. Par contre les activités enzymatiques sont quasiment

perdues.
• Tétraoxyde d'osmium: Il s'agit d'un agent oxydant, il complète l'action d'un
fixateur avant l'inclusion en microscopie électronique. Il est toxique et oxydant.
dégrade les protéines.

• L'acétate d'uranyle: réagit avec les lipides et les acides nucléiques. Surtout
utilisé pour renforcer le contraste des structures.

• Autres moyens: congélation brutale afin de vitrifier l'eau . Cela évite les
traitements chimiques très toxiques et nocifs.
Avantage et inconvénients des fixateurs
• le formol seul ou formaldéhyde dilué dans l’eau courante
• économique,
• incolore,
• permet la fixation de grosses pièces,
• MAIS
• allergisant,
• carcinogène
• Il n’y a pas de fixateur idéal

• Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients.

• Parmi des centaines disponibles


• Les fixateurs contenant du formol

• AFA (Acide acétique Formolé Alcool)

• Fixation très rapide (risques de surfixation),

• permet les marquages immunohistologiques.

• peu pénétrant.
• MAIS
• idéal pour les biopsies
• Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique)
• rapide,

• pénétrant,
• légères rétractions tissulaires,

• très belles colorations topographiques,

• MAIS

• ne permet que difficilement


l’immunohistologie,
• coloré : tache ! (et ne part qu’avec
l’épiderme).
Etape N°4 – Circulation du tissue et imprégnation
en paraffine
• L'échantillon en cassette est imprégné de paraffine. Pour cela, il subit trois sous-
étapes succéssives en raison du caractère hydrophobe de la paraffine:


•Il faut bien identifier les casettes à l’aide

d’un crayon à la mine.

•N’utilisez jamais de crayon à l’encre


• Première étape de la circulation;

La déshydratation

• L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine.

• Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux.

• On procède donc par étapes en remplaçant :

• l’eau par un alcool

• l’alcool par un solvant organique (Toluène),

• Toluène par la paraffine


NON
• Circulation : Étape consistant à faire pénétrer la paraffine au sein du tissu

• Déshydratation des tissus : 3 bains d’alcool a concentrations croissantes c'est-

à-dire : 70%-85%-90%, pour que le tissu ne subisse ni distorsion ni

durcissement.

• On termine avec 3 bains d’alcool absolu afin d’enlever complètement l’eau

des tissus.
• L’éclaircissement : 3 bains de toluène à 100% qui servent à remplacer

l’alcool dans les tissus afin que celui-ci soit miscible avec la paraffine.

• Le toluène éclaircira le tissu pour que son indice

• de réfraction soit plus élevé et augmentera sa transparence.

• L’imprégnation : bains de paraffine chaude (44˚Cà 60 ˚C)

• pour solidifier le tissu.


La coupe histologique
•. :
• la coupe ne peut être pratiquée que dans une
substance assez dure ; c’est pourquoi on imprègne les
tissus d’une substance d’enrobage, en général la
paraffine.
• On refroidit alors et on obtient un bloc de paraffine
durcie contenant le tissu à examiner.
L’enrobage
Il est difficile de couper un organe fixé en tranches suffisamment minces
pour être observables au microscope.
Puisqu'un un bloc de cire peut être tranché très finement.
Cette méthode permet d'obtenir des coupes d'organes aussi minces que
possible.
Le prélèvement est imprégné de paraffine fondue
On coule la paraffine fondue contenant le prélèvement dans un moule
A température ambiante, la paraffine se solidifie afin de le rigidifier pour
pouvoir le couper ensuite
• Ex : paraffine, résines hydrophobes, résines hydrosolubles.

• Le milieu d'inclusion idéal: totalement soluble dans l'eau ;

• point de fusion très bas (pour ne pas détruire les protéines) ;

• chimiquement inerte ;

• doit être perméable aux réactifs, doit pouvoir polymériser, sans libérer de
sous-produits ;

• facile à couper ; bonne cohésion avec les tissu.


La paraffine NON
• Le mot paraffine vient du latin parum affinis,
• un produit extrait des résidus solides du pétrole — d'où la
dénomination de « graisse minérale ».
• L'extraction a lieu à basse température, avec du propane liquide
additionné aux goudrons.
• En raison d'une demande globale croissante, les chercheurs et
industriels essaient de développer de la paraffine d'origine végétale, à
base de lipides.
• NON

• On distingue les paraffines


constituées d'alcanes linéaires
(n-alcanes) et celles constituées
d'alcanes ramifiées (iso-alcanes).
• les paraffines liquides ou fluides (paraffinum perliquidum), (n = 8 à
19) dont la viscosité est de 25 à 80 mPa.s ;
• les paraffines huileuses ou pâteuses (paraffinum subliquidum), dont
la viscosité est de 110 à 230 mPa.s ;
• les paraffines solides (paraffinum solidum), cires (n = 20 à 40) dont la
température de figeage (solidification) se situe entre 50 et 62 °C.
• mPa.s =Millipascal-second
• Elle ne colle pas. Elle n’est pas un liant, contrairement à la cire
d’abeille et certaines cires végétales
• Inconvénients :

• Il peut y avoir des réactions avec des tissus.

• La structures tissulaires est rarement

• <0,6µm.
• Les résines hydrosolubles:

• - résines plus dures que la paraffine = milieu de soutien plus


résistant

• - En photonique : 3 avantages :

• coupes plus fines donc meilleure résolution et détails plus fins ;

• moins de distorsion des tissus ;

• sont hydrosolubles.
Remarque :Pour la ME
• Les coupes ultrafines des blocs sont réalisées grâce à un
ultramicrotome qui permet
• d'obtenir des coupes ultrafines d'environ 80 nm d'épaisseur.
Les coupes sont recueillies sur des grilles de cuivre.

• Avec le même ultramicrotome, on peut faire des coupes


semifines, observables en MO et permettant de guider le
choix des zones à étudier en ME.
• Le contraste des coupes s'effectue habituellement avec de
l'acétate d'uranyle (contrastant les nucléoprotéines : noyau,
nucléole, ribosomes) et des sels de plomb comme le citrate
de plomb (contrastant les membranes).
Remarque :Pour la ME :

• La fixation se fait habituellement dans de la


glutaraldéhyde tamponnée et est suivie d'une post-
fixation à l'acide osmique.
• L'inclusion se fait dans une résine synthétique type
Epon ou Araldite, après que les fragments ont été
déshydratés dans les alcools et dans l'oxyde de
propylène.
Etape N°5 - Microtomie

• L'échantillon ainsi imprégné et enrobé de paraffine solide peut-être


coupé à l'aide d'un microtome rotatif.
• Cet équipement semi-automatique permet d'obtenir des coupes
successives et d'épaisseur répétables.

• La coupe est déposée et fixée sur une lame de verre microscopique
portant le numéro de traçabilité.
• le microtome
• reculer le porte objet au maximum
• placer le bloc dans le porte objet sans le
fixer
• placer le rasoir face gravée vers l'extérieur
• couper dans un plan vertical, parallèle au fil
du rasoir, les deux
• arêtes du bloc les plus longues
horizontalement
• dégrossir à la main
• régler l'épaisseur des coupes (5 microns)
• NON

• On distingue plusieurs types de coupe selon la méthode de


conservation et d'amincissement suivie :
• Les coupes histologiques (MO)

• 2 à 5 μm d’épaisseur,

• quelques centimètres de largeur et


longueur,

• nombreuses colorations possibles,

• montées entre lame et lamelle,

• grandissement de 10 à 1000 fois


(environ).
• DIFFICULTES
• l'inclinaison du rasoir
• la fixation au porte objet
• coupes striées essuyer le rasoir ou le déplacer
• coupes irrégulières vérifier la fixation du rasoir et du porte-
objet
• La cire doit être assez froide, pour obtenir un ruban.
=>Mettre le bloc de paraffine au
• congélateur si besoin ou utiliser une bombe cryolab qui
refroidit la surface de la cire.
La fixation au formol et la congélation préservent les ADN, mais
seule la congélation préserve les ARN
•Les lames gravées et garnies de ruban de
paraffine sont disposées sur une platine
chauffante
• Les coupes sont placées dans une étuve
dont la température est légèrement
inférieure au point de fusion de la
paraffine, pendant au moins 30 minutes.
•Si le tissu est particulièrement fragile, les
coupes sont séchées dans une étuve à 37°
pendant toute une nuit. Les coupes
peuvent alors être colorées.
Inconveignants
• Immunohistochimie :

1- Antigènes sensibles à la chaleur


2- A la déshydratation
3- Aux réactions chimiques (précipitation lipidique…)
4- A l’inclusion et la polymérisation en paraffine (démasquage
indispensable)
Inclusion lourde, automate à inclusion indispensable
Immunofluorescence non adaptée (bruit de fond)
Applications
• Immunomarquages en fluorescence ou enzymatique
Hybridation in situ
• Coloration
Cryostat 2 (s)

• (7µm à 40µm)
Coupes de tissus fixés ou non fixés
Congélation à l'azote liquide

• Observations:
Microscopie photonique
Microscopie à fluorescence (ApoTome)
Avantages
• Technique rapide, de choix pour la mise en évidence d’antigène
‘difficiles’, antigènes liposolubles…
Possibilité de travailler sur tissus fixés ou non fixés
Pas de dégradation des sites antigéniques : Protéine (enzyme,
récepteur, mARN …) substance chimique (neurotransmetteur…)
Ø Pas d’inclusion
Ø Pas de déshydratation
Ø Pas de polymérisation
Ø Pas de chaleur
Ø Pas de réactions chimiques
Inconvegnants
• Technique difficile à maîtriser, coupes souvent irrégulières
Préservation morphologique variable selon les tissus, présence de
cristaux de glace (trous)
Ultramicrotome (s)

• (0,25µm à 2µm)
Coupes de tissus fixés
Imprégnation en résine epoxy
(50nm à 100nm)

• Observation:
Microscopie photonique
MET
Scanner de lames-Nanozoomer
Applications
• Microscopie photonique coupe fine de 1µm
1-Contraste des structures au bleu de toluidine
2-Etude qualitative et quantitative, coupes sériées :
analyse d'images et comptage
Microscopie électronique à transmission (MET)
1-Immunomarquages des structures fines en MET:
« Pre-embeding et Post-embedding »
Avantages

•Seule technique histologique permettant


d’observer au niveau ultrastructural
Morphologie +++

•Pour l'immunomarquage : nécessité d'une


mise au point en fonction des tissus
• Technique longue a mettre en œuvre
Paramètres de préparation à respecter
strictement
Nécessite un technicien(ne) expérimenté(e)
Vibratome (s)
• (50µm à 500µm)
Coupes épaisses de tissus fixés ou vivants
Possible imprégnation en gélose pour des petites
pièces
• Applications:
• Immunomarquages en fluorescence
Hybridation in situ
Electrophysiologie (patch-clamp…)
Culture : explants
Préparation de coupes pour l\'inclusion en MET
Le vibratome
• Le vibratome permet de réaliser des coupes à l’aide d’une lame de
rasoir vibrante. L’échantillon est immobile et c’est la lame qui bouge
selon des paramètres fixés par l’utilisateur.
• Paramètres réglables :
– Fréquence de vibration de la lame de 30 à
100Hz
– Amplitude de vibration de la lame de 0.1 à 1.2
mm par incrément de 0.1 mm
– Vitesse de coupe de 0 à 5 mm s-1
– Epaisseur de coupe de 1 à 1500 μm par
incréments sélectionnables de 1, 2, 5 ou 10 μm
• Distorsion verticale de la lame inférieure à 5 μm quelles que soient les
valeurs de fréquence et d’amplitude.
Orientation de la platine porte-objet sur 8°. Rotation de la platine
porte-objet sur 360°.
Avantages
• Coupes très épaisses (50µm à 500µm)
Coupes sur tissus vivants (cuve refroidissante à 4°C) ou sur tissus fixé
Très bonne morphologie
Immunofluorescence ++

Reconstitution en 3D
• Technique de coupe difficile à maitriser:
• Mise au point selon les tissus
• Difficultés de coupes pour les spécimens de dureté hétérogène
• Problèmes de pénétration des anticorps sur coupes épaisses

• Démasquages des sites antigéniques


• Observations:
Microscopie Confocal en 3D
Microscopie bi-photonique
Fixation de la coupe sur la lame
• Sur une plaque chauffante maintenant une température de
50 °C.
• On place une lame sur laquelle on dépose une solution eau
distillée albuminé à 1% en veillant à
• faire un dôme d’eau sur la lame pour éviter des bulles d’air.
L’eau albuminé permet à la coupe de
• bien glisser sur la lame.
On peut utiliser un bac d’eau chaude.
Rajouter dans l’eau chaude du stick on qui permet une meilleur fixation.
10ml dans un L d’eau
• On dépose alors la coupe histologique sur la lame.
• On égoutte la lame , en renversant simplement l’eau sur un sopalin.
• On place la lame droite pour bien faire sécher. Par exemple sur un
sopalin.
• Puis on place la lame dans une étuve à 56°C pendant 1 h.
• Cela permettra de faciliter d’enlever le reste de paraffine et de bien
permettre la fixation de la
• coupe sur la lame.
Etape N°6 - Coloration

• La coloration des coupes est indispensable pour


mettre en évidence et visualiser la morphologie des
tissus et cellules.

• Les lames histologiques étant hydrophobes, elles doivent être au
préalable déparaffineés par immersion dans plusieurs bains de
xylène ou toluène ou substitut. Réhydratation des lames dans
différents bains d'alcool croissants puis dans de l'eau. Les lames
peuvent alors être immergées dans les colorants.

• Différent de l'immunohistochimie (immunomarquage) et de l'hybridation in situ.
colorations
• But: colorer les structures et/ou des constituants moléculaires pour les
visualiser, localiser, identifier.
• Colorant = produit susceptible de teindre une ou plusieurs structures de
façon durable

• Il existe différentes types de colorations : coloration histologique, coloration


structurale, coloration cytologique, coloration vitale.
• Colorations topographiques : ce sont celles qui différencient le mieux
les différents tissus constituants d'un ensemble et permettent la
visibilité en général jusqu'aux noyaux, d'un organe.

• · Colorations histologiques : ce sont celles qui différencient finement


tous les éléments d'un tissu y compris ses structures fines et ses
excrétats ou sécrétats. Une telle coloration devient histochimique si elle
est spécifique de tel ou tel composé défini.
•  Colorations cytologiques : ce sont celles qui permettent d'analyser les
détails internes des cellules. De telles colorations peuvent être cytochimiques
si elles mettent en évidence des fonctions chimiques déterminées.

• · Colorations progressives : elles nécessitent d'arrêter la montée de la


coloration au point voulu
• · Colorations régressives : sur coloration, on différencie par un
réactif qui enlève progressivement l'excès de colorant.

• · Colorations directes : elles se fixent directement sur l'objet.

• · Colorations indirectes avec mordançage : la fixation du colorant


a lieu par l'intermédiaire d'un sel métallique "mordant".
• Colorations de routine
• Après dissolution de la paraffine, puis réhydratation, le
tissu est coloré. La coloration usuelle associe un colorant
basique nucléaire (hématéine, hématoxyline)
• et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou
phloxine). On y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le
collagène
NON
Colorants acides

• Les colorants acides ont une bonne affinité avec les substances alcalin
es, ils mettent en évidence des tissusbasiques donc acidophiles.
• éosine (rouge)
• acide picrique (jaune)
• vert rapide
• Orange G
• fuchsine acide (rouge)
• érythrosine
Colorants basiques

• Ils mettent en évidence des tissus acides, dits basophiles.


• Hématoxyline (bleu)
• Safranine (rouge)
• carmin (rouge)
• thionine (bleu)
• fuchsine basique (rouge)
• Colorations argentiques
• Certains tissus fixent l'argent. On parle de struct
ures argentaffines ou de structures argyrophiles
.
• Coloration aux sels de Chrome
• On met ainsi en évidence les tissus chromaffines
, comme la médullo-surrénale.
Facteurs influant la distribution des colorants dans les tissus et
la qualité de la lame en général

• Fixateur(pH,VOLUME,TEMPS),colorants(concentration,pureté,
• filtration,changement régulier des bains),l’épaisseur de coupe du
tissu.
• Chaque étape est importante pour l’obtention du matériel d’analyse.
NON