UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS EXACTAS E NGENIERÍAS

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

DETECTOR DE FLUORESCENCIA
Y QUIMIOLUMINISCENCIA
PARA HPLC
CARRILLO MACÍAS JENIFER LIZETH
RAMÍREZ RODRÍGUEZ KARLA GRACIELA
ROMERO ÁLVAREZ DANIELA
QUÍMICA ANALÍTICA III / VERANO 2018
FLUORESCENCIA (FL)
¿Qué es el fenómeno de fluorescencia?

 El fenómeno de la fluorescencia tiene lugar cuando compuestos

que poseen determinados grupos funciones específicos excitan
con la energía de ciertas longitudes de onda y emiten radiación
de mayor longitud de onda que la absorbida.
¿Cómo se
produce?

 Los electrones son

excitados a estados
vibracionales y
rotacionales más altos
y cuando vuelven a su
estado fundamental
emiten la energía de
excitación en forma
de radiación.
EXCITACIÓN DE FOTONES
 FLUORSCENCIA

 En fluorescencia , la radiación emitida se mide normalmente , con el objetivo de

evitar interferencias en dirección perpendicular a la de incidencia del haz de
excitación. Naturalmente la posibilidad real de detectar por fluorescencia
grupos químicos específicos es función de las longitudes de onda seleccionadas,
tanto la de excitación como la de emisión
 COMPUESTOS
CON
FLUORESCENCIA
NATURAL
Ventajas

 En la detección por fluorescencia, además de aumentar la sensibilidad, también

aumenta la especificidad. Los detectores de fluorescencia son los más
específicos detectores ópticos, lo que se usa ventajosamente para la detección
de especies con una fluorescencia específica en muestras complejas.
 Si se utiliza instrumentación que permita efectuar tantos barridos de excitación
como de emisión, existe la posibilidad de proporcionar datos para la
identificación de picos a través de los espectros de excitación y de emisión,
utilizando técnicas de registro con paro de lujo.
 ESPECTROS DE
EXCITACIÓN Y
EMISIÓN
 Los espectros de
excitación y emisión de
una substancia,
proporcionan gran
información que con una
instrumentación
sofisticada, que permita
conocer los espectros
corregidos, se puede
realizar una interpretación
estructural de los espectros
de fluorescencia, lo que
permite llegar a la
identificación de los
compuestos que eluyen de
la columna.
REACTIVOS
UTILIZADOS PARA
LA DETECCIÓN
POR
FLUORESCENCIA
DETECTORES EN FLUORESCENCIA

 Los detectores de fluorescencia representan el tercer tipo de detectores más

comúnmente utilizados en CL. Para los compuestos que presentan fluorescencia
natural (fluorescen porque contienen estructuras con configuraciones
moleculares particulares conocidas como fluoróforos o fluorocromos) , así como
para los que pueden convertirse en fluorescentes, es el tipo de detección más
sensible que se puede aplicar de rutina a la CL.
 Normalmente la sensibilidad del detector de fluorescencia es 1,000 veces
mayor que la del detector UV, para compuestos con absorción UV intensa.
GERERALIDADES

Los detectores más

sencillos utilizan una
fuente de excitación de
mercurio, y uno o más
filtros para aislar la
radiación fluorescente
QUIMIOLUMINISCENCIA
(CL)
¿QUIMIOLUMINISCENCIA?
 Similar a FL, pero en lugar de
utilizar una fuente de luz
para excitar los átomos de
analIto, la excitación se
inicia por reacción química.

la ausencia de niveles altos de

luz de fondo, que sí ocurren en
espectrofotometría y
fluorimetría, reduce el ruido y
permite mejorar los límites de
detección. Proporcionando
mayor sensibilidad.
 MECANISMO DE REACCIÓN

REACCIÓN DIRECTA: dos reactivos reaccionan

para formar un producto o intermedio de la
reacción, el intermedio pasa a un estado
electrónicamente excitado, que puede a
continuación relajarse hasta el estado
fundamental con emisión de un fotón.
REACCIÓN INDIRECTA: En el caso de moléculas
que no pueden emitir directamente QL, este
proceso permite transferir su exceso de energía
a un fluoróforo que a su vez es excitado,
volviendo a su estado fundamental con la
emisión de un fotón. se basa en un proceso de
transferencia de energía de la especie excitada
a un fluoróforo.
MECANISMO DE REACCIÓN
 LIMITACIONES

 La dependencia de la emisión con varios factores ambientales que deben ser

controlados.
 La emisión quimioluminiscente no es constante sino que varía con el tiempo.
(alcanzando la luz un máximo, para después caer hasta la línea base).
Detectores de quimioluminiscencia
La mayor ventaja de la
quimioluminiscencia es que no
requiere haz de excitación,
elemento esencial en fluorimetría.
Son detectores de muy alta
sensibilidad, y permiten la
detección de trazas de lípidos,
nucleótidos, óxidos nitrosos y
catecolaminas.

VENTAJAS
 Hay cuatro requerimientos básicos para el
detector
o Debe ser capaz de detectar una señal desde
unos pocos fotones por segundo a decenas
de millones por segundo
o Debe ser sensible al menos en la región
DETECTOR DE espectral de 400-600 nm, idealmente en la
región completa del visible (380-750 nm)
QUIMIOLUMINISCENCIA incluso en la regiones pertenecientes al UV e
IR,
o La señal producida por el detector debe
poder ser fácilmente leída, registrada y
analizada
o la velocidad de respuesta del detector debe
ser más rápida que la velocidad de la
reacción de QL, si no, la señal será una
versión distorsionada de la señal original.
 La luz es detectada por dispositivos fotosensibles
que generan una fotocorriente. Los
fotomultiplicadores son los detectores más
comúnmente utilizados en QL

DETECTOR DE
QUIMIOLUMINISCENCIA
FOTOMULTIPLICADOR

El fotomultiplicador es un dispositivo que permite detectar luz con alta sensibilidad.

Consta básicamente de un elemento (fotocátodo) en donde, por efecto fotoeléctrico,
se produce un electrón (fotoelectrón) que es acelerado hacia una serie de electrodos
(dinodos) debido al campo eléctrico creado por una tensión suministrada
externamente. Este fotoelectrón inicial va siendo multiplicado en las distintas etapas a su
paso por los dinodos obteniéndose en el último de ellos (ánodo) una corriente
apreciable que sobre una resistencia de carga adecuada puede formar un impulso de
tensión detectable.

Un fotocátodo es un dispositivo sensible a la luz formado por una capa de una sustancia
metálica como el antimonio o el sodio sobre una base de cuarzo o vidrio y que
descarga electrones cuando se expone a cierto nivel de luminosidad.
FOTOMULTIPLICADOR
 Es el detector cromatográfico más sensible y
selectivo disponible para el análisis de
compuestos nitrogenados. Esto se logra por
DETECTOR DE medio de un quemador de acero inoxidable
que otorga una alta temperatura de
QUIMIOLUMINISCENCIA combustión, formando el monóxido de
DE NITRÓGENO nitrógeno (NO) el tubo fotomultiplicador
detecta la luz producida por la reacción
(NCD) quimioluminiscente del monóxido de oxigeno
con el ozono.

MECANISMO DE REACCIÓN

N-compuesto + O --> NO + Otros productos

NO + O3 --> NO2 + O2 + λ (800-3200nm)
 Este detector permite el análisis de compuestos
orgánicos nitrogenados, el NCD también
responde al amoníaco, hidracinas, cianuro de
DETECTOR DE hidrógeno, se puede utilizar para análisis
QUIMIOLUMINISCENCIA secundarios de petróleo, productos químicos y
petroquímicos, análisis de alimentos y bebidas,
DE NITRÓGENO fragancias, y análisis ambiental.

(NCD)
 Este detector es sensible y selectivo disponible
para el análisis de compuestos de azufre.
utiliza un quemador dual que trabaja con altas
temperaturas para generar la combustión
DETECTOR DE compuestos de azufre y formar el monóxido de
QUIMIOLUMINISCENCIA azufre (SO).

DE AZUFRE(SCD)

MECANISMO DE REACCIÓN

S-compuesto + O --> SO + Otros productos

SO + O3 --> SO2 + O2 + λ (300-400 nm)
 el eluyente se mezcla con hidrógeno y aire y se
produce la combustión como en el detector de
ionización de llama, formando el monóxido de
azufre (SO), En una segunda etapa, el
fotomultiplicador detecta la luz producida por
la reacción quimioluminiscente del monóxido
DETECTOR DE de oxigeno con el ozono.
Permite detectar compuestos que contienen
QUIMIOLUMINISCENCIA sulfuro (alimentos, bebidas, petróleo).
DE AZUFRE(SCD)
 REFERENCIAS

 Los detectores para HPLC, recuperado de https://www.shodexhplc.com/lessons/leccion-6-los-

detectores-para-hplc/
 Detector de quimioluminiscencia de nitrógeno, recuperado de http://www.ingenieria-
analitica.com/detector-de-quimioluminiscencia-de-nitrogeno-ncd.html
 Detectores de quimioluminiscencias de azufre, recuperado de http://www.ingenieria-
analitica.com/ncd-scd.html
 http://www.icp.csic.es/abgroup/web3/documentos/Tecnicas_Analisis_baja%20sin%20ind%20a
nalitico_0789.pdf
 Quimioluminiscencia, recuperado de
http://digibug.ugr.es/bitstream/handle/10481/28259/Ars%20Pharm.2001%3b42%281-2%2981-
107.pdf?sequence=1&isAllowed=y
 Urida, J. (2001) “Fotomultiplicador” Universidad Complutense de Madrid, España, recuperado
de: http://nuc1.fis.ucm.es/LABORATORIO/GAMMA/node4.html