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Cours de Chromatographie

Historique
 1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, sépare des pigments vé
gétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium
pulvérulent, les pigments sont entraînés avec de l'éther de pétrole

 1940 : Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la


chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952

 1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (C


PG)

 1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Perfo


rmance CLHP ou HPLC en anglais

 1979 : première séparation chirale par HPLC


le succès de la chromatographie comme technique analytique t
ient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés un
e méthode séparative rapide et performante et des détecteurs se
nsibles et variés permettant non seulement, une quantification
des espèces séparées, mais aussi, pour certains d'entre eux, une
identification des espèces.

De ce fait, la chromatographie se prête bien à l’analyse de mél


anges complexes tels ceux que l’on peut rencontrer dans des d
omaines aussi différents que:
- les produits pétroliers,
- les polymères
- les fluides biologiques
- l’analyse de traces dans des milieux aussi variés que l
’étude de l’environnement ou le contrôle de la pureté optique d
e molécules thérapeutiques.
- ect…
Qu’est-ce que la chromatographie?
éluant

Bande initiale avec les co


mposés A et B

PS tassée dans la col


onne + PM

disque poreux

B A
éluat
Chromatographie - définition -

Méthode de séparation des constituants d’un mélange reposant s


ur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un comp
osé est mis en présence de deux phases non miscibles
- La phase mobile tend à entraîner les espèces à
séparer dans son mouvement,
- La phase stationnaire tend à les retarder, d’aut
ant plus fortement que les interactions mises en je
u sont plus intenses, nombreuses et plus énergétiq
ues.

Il en résulte que les analytes ont, pour la plupart, des vite


sses de déplacement différentes et inférieures à celle de l
a phase mobile, d’où la notion de rétention et la possibil
ité de séparations.
• Phase stationnaire (PS) : immobilisée dans une colonn
e ou fixée sur un support plan(CCM)

• Phase mobile (PM) : se déplaçant au contact de la pre


mière, sa vitesse dans la colonne est exprimée :

 en débit,D : volume de solvant traversant la colonne pa


r unité de temps (mL/min)

 en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la colon


ne par unité de temps (cm/min)

• Elution : processus par lequel un composé est entraîné


par le mouvement de la phase mobile à travers la phase
stationnaire
Chromatographie – classification -
 Selon le phénomène physique responsable des échanges entre PS
et PM :
 adsorption
 partage
 échange d’ions
 exclusion
 affinité
 Selon la nature physique de la phase mobile :
 liquide
 gaz
 Selon l’objectif visé :
 chromatographie analytique
 chromatographie préparative
Selon le support de la PS
 Chromatographie sur colonne
 Chromatographie su couche mince
Chromatographie planaire

Les méthodes de chromatographie planaire comprennent:


-la Chromatographie sur Couche Mince: CCM,
-la Chromatographie sur Papier CP et
-l'electrochromatographie planaire.

Une fine couche de phase stationnaire à base de gel de silice est dépos
ée sur une plaque de verre, de plastique ou d'aluminium. La nature des
phases mobile et stationnaire ainsi que la théorie sont les mêmes qu'en
chromatographie sur colonne.
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

• La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principal


ement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est
un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’
une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une
feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.

• Les principaux éléments d’une séparation chromatographique


sur couche mince sont :
- la cuve chromatographique
- la phase stationnaire
- l’échantillon
- l’éluant
Principe de la CCM

• Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est pla


cée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase stationnaire,
essentiellement par capillarité.

• Chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vites


se derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part,
des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque
stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobi
le.

• Les composés se déplacent donc alternativement de la phase st


ationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase s
tationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes
d’adsorption.

• Généralement, en chromatographie sur couche mince, les subst


ances de faible polarité migrent plus rapidement que les compo
sants polaires.
Principales étapes d’une CCM
1.Choix de l'éluant :

Les éluants :
Les hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
Les solvants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions var
iables avec du benzène ou de l'éther diéthylique forment un éluant de
polarité moyenne.
Les composés polaires : éthanoate d'éthyle, propanone ou méthanol.
2. Dépôt de l'échantillon.

• L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas forcé
ment le même que l'éluant. La solution est déposée en un point de la plaque situé à e
nviron 1 cm de la partie inférieure.

• Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible.
Il est toujours préférable d'effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant rapi
dement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un grand vo
lume d'échantillon qui produirait une tache plus large.

• L'échantillon est déposé à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire.

• On vérifie l'identité des composants présumés d'un échantillon, en procédant à un dé


pôt séparé d'une solution de chacun d'eux puis à celui de leur mélange. Ces solutions
témoins permettent de comparer la migration de chaque composé avec celle de l'éch
antillon à analyser.
3. Développement de la plaque.

• la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant q


ui en recouvre le fond monte par capillarité.

• Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve; on


place souvent du papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer
plus rapidement la cuve en vapeurs d'éluant et éviter les effets de bord
s. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit demeu
rer fermée et ne pas être déplacée.

• Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l'extré


mité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atténué par l
e solvant (front du solvant) est marqué avant le séchage de la plaque.
Le rapport frontal (B/A) d’un produit donné dépend de nombreux para
mètres :
-nature du revêtement de la plaque CCM (silice ou alumine),
-concentration de l’échantillon,
-nature des solvants d’élution.
 La CCM est utilisée pour séparer des composants dan
s un but d'analyse (CCM analytique) ou de purificatio
n (CCM préparative).
Exemple d’une CCM
 On trace un trait horizontal (la ligne de base) à enviro
n 1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques D,
B et M représentent respectivement le produit de Dép
art, le Brut réactionnel et le point Mixte (un mélange
de D et B). Le point mixte permet de mieux visualiser
les taches lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'ét
ape d'élution est imparfaite.
Détection

● Détection directe pour les composes colorés.

● Une méthode de détection consiste à vaporiser un "réactif", par ex


. une solution d'acide sulfurique ou d'iode, qui réagit avec les comp
oses organiques pour former des produits colorés.
Des réactifs spécifiques peuvent être utilisés: ex: la ninhydrine en s
olution alcoolique pour les acides aminés.

● Les composés qui donnent des taches invisibles doivent être "révé
lés". Dans ce cas, la phase stationnaire contient un sel de zinc qui é
met une fluorescence verte quand la plaque est éclairée par une lam
pe a valeur de mercure (l = 254 nm).
Tout compose qui absorbe a cette l, apparait sous forme d'une tach
e sombre sur un fond illuminé en vert.
Applications et avantages de la CCM
• Elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’u
n composé organique.

• Elle peut être employée pour suivre la progression d’


une réaction.

• La CCM présent les avantages ci-après :


- la rapidité d'exécution (1 à 2 heures),
- la simplicité d'exécution,
- un coût modeste,
- la sensibilité de l'ordre des microgrammes (ug).
CCM Bidimmentionnelle
Deux élutions successives sont effectuées dans deux directions avec deux
éluants différents. Apres développement avec un solvant, la plaque est re
tiree, séchée, tournée de 90 degrés puis développée avec un autre solvant
.
Description d'une expérience de CC

Le composé jaune interagit peu avec la phase fixe, il est donc peu rete
nu; il sort le premier, entraîné par le débit de la phase mobile.
éluant

Bande initiale avec les co


mposés A et B

PS tassée dans la col


onne + PM

disque poreux

B A
éluat
Chromatogramme
signall

Temps (min)
Si , en bout de colonne, on place un détecteur qui répond à la concentrati
on du soluté,on obtient un graphique d’une fonction de la concentration e
n soluté en fonction du temps.c’est le chromatogramme
En considérant la nature de la phase stationnaire et son interaction av
ec les molécules de soluté, les séparations chromatographiques sont c
lassées en 5 principaux types:

1. Chromatographie de partage en phase normale ou inversée


2. Chromatographie d'adsorption
3. Chromatographie d'exclusion stérique
4. Chromatographie sur échangeur d'ions
5. Chromatographie d'affinité
6. Electrochromatographie

Rem. L'efficacité d'une colonne augmente quand la taille des particu


les de support diminue et donc que la hauteur équivalente a un plate
au théorique diminue.
Chromatographie en phase liquide

type phase stationnaire

adsorption solide poreux

solide à la surface duquel se trouvent des sites ioniques


qui permettent à l'aide d'un solvant approprié l'éc
échange d'ions
hange
d'ions présents dans la phase mobile
liquide/solide
d'exclusion
(filtration sur g solide dont la dimension des pores permet la séparatio
el, n
perméation de des espèces selon leur taille
gel)

partage solide poreux inerte enrobé de liquide


phase normale (de moins en moins utilisée)
liquide/liquide
partage solide poreux sur lequel sont greffées
phase inversée des chaînes hydrocarbonées non-polaires
1.Chromatographie de partage
Le mécanisme de séparation est le partage entre la PM
et la PS.

La PS peut être un film liquide imprègné sur un suppo


rt (silice) mais il a tendance a être emporté avec la PM (
"lessivage", "bleeding"), ou une phase organique fixée p
ar liaison covalente sur un support (gel de silice) (phase
greffée).

On distingue deux types de chromatographie de parta


ge selon les polarités relatives des phases mobile et stati
onnaire:
Chromatographie à polarité de phase normale
(mode normal ou direct):

La phase stationnaire est polaire, de nature hydrophile, ave


c des groupements: amine: NH2 , nitrile: CN,
dialcool ou diol: (CHOH)CH2OH, greffés sur la silice.

La phase mobile est un solvant apolaire, de nature lipophile


: l'hexane ou l‘éther isopropylique

Le soluté le moins polaire est élué en premier.

Rem:
- alkyles: C8: (CH2)7CH3 et C18:(CH2)17CH3 , apolaires;
- phenyle: (CH2)nC6H5 apolaire
Chromatographie à polarité de phase inversée
(reversed phase, mode inverse)

C'est la phase stationnaire, constituée souvent d'un hydrocarbure


qui est apolaire, de nature lipophile, avec des chaines alkyles de
C4 à C30 , des groupements propyle, phényle, diphényle.

La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol, ou le


cyanure de méthyle (acétonitrile).

Les colonnes C18 sont remplies de silice greffée en phase inverse


C18 , ou "gel de silice C18" : SiOSi(CH3)2(CH2)17CH3 ;

les colonnes C4 sont utilisées pour séparer les peptides et les proté
ines, les C30 pour les caroténoides et les flavanoides.
La chromatographie de partage est basée sur la différen
ce de solubilité des substances à séparer dans deux fluid
es non miscibles. Le facteur principal qui intervient est
le coefficient de partage entre chaque phase. On ne peut
séparer que des solutés dont les coefficients de partage
entre les deux phases sont différents.
Phases stationnaires (adsorbants)
• Des oxydes inorganiques comme le gel de silice et l'alumine so
nt utilisés
• pour la PS. Les propriétés chromatographiques de ces oxydes
dépendent de la taille des particules, de leur surface spécifique,
du volume spécifique des pores et de leur diamètre.
• Il existe des silices greffées par des groupements attachés par l
iaisons covalentes aux fonctions silanols de la surface:
● des greffons polaires: nitrile, amine, alcool.
● des greffons alkyle apolaires utilises en mode inverse: RP8, RP
18, (reversed phase octyl and octadecyl groups).
● des silices C18 greffées imprégnées d'un sélecteur chiral.
● des supports à base de poudre de cellulose utilisés pour la sépar
ation de composés polaires: acides carboxyliques, acides amin
es, phosphates..
Par ordre d’importance décroissante, les adsorbants employés en CCM
sont : le gel de silice, l’alumine et la cellulose.
- Insolubilité totale dans les solvants et éluants utilisés;
- Inertie chimique vis à vis des solvants et des substances à chr
omatographier.

La silice SiO2
Son pouvoir adsorbant est dû à son caractère acide, polaire et à la poss
ibilité de former des liaisons hydrogène ce qui explique son emploi c
ourant surtout dans le cas de la chromatographie des composés polai
res.

Du fait de son caractère acide, la silice retient fortement les composés


à caractère basique et pour éviter cela, les sites acides sont masqués
soit par une base (soude ou potasse ) soit en ajoutant aux éluants de
petites quantités d’amines ou d’ammoniaque.
Le gel de silice
● C'est un solide amorphe, un polymère inorganique de formule SiO
2(H2O)n avec n proche de 0, la silice naturelle cristalline étant de fo
rmule: SiO2.. La structure est de type tétraédrique avec groupements
silanol: SiOH

● Il est très polaire. Avec un éluant apolaire, les solutés polaires sont
retenus dans la colonne, contrairement aux solutés apolaires qui sort
ent en premier.

● Le mécanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption.

● Avec les particules de faible diametre, d ~ 2 μm, la surface de con


tact , la HEPT et l'efficacite de la colonne .
Surface du gel de silice sec et hydraté
Des molecules d'eau peuven
t se fixer par liaison hydrog
ene pour former un gel + o
u - hydraté
OH-----OH2
L’alumine (AL2O3)

• Elle est obtenue par précipitation des sels d’aluminium par


les bases fortes ; elle est donc à caractère plutôt basique.

• Elle s’hydrate facilement au contact de l’air (très hydroph


ile) ce qui nécessite une température assez élevée (environ
200°).
Si-OH : fonction silanol

(CH3)2Si O : groupement diméthylsiloxane (de


silicium, oxygène et alcane)

Si - O - Si : pont ou liaison siloxane

SiH4 : silane (cf. CH4 méthane)


• L'intérieur de chaque grain de silice est composé d'ato
mes de silicium reliés entre eux par des atomes d'oxy
gène (un silicate).

• En surface, des groupes silanol (Si–OH) subsistent et


sont responsables de la très forte polarité du gel de sil
ice. En présence d'eau, cette surface s'hydrate ce qui p
rovoque une diminution de la polarité.

• Les grains de gel de silice sont poreux et la taille des


grains et des pores sont responsables de la surface spé
cifique du gel.
Le gel de silice comporte des pores de différentes dimensions

a) Les particules sont homogènes; b) Le xerogel


la porosité : 50% Sa porosite : 70%;
le diamètre des pores :10nm; sa surface de contact : 300 m2/g
la surface de contact (surface spé Diamètre des pores : 10nm.
cifique):150 m2/g. (porosité=Volu
me vide/ Vtotal)
Les phases stationnaires greffées

Le gel de silice est hydrophile. Ses caractéristiques évoluent dans l


e temps, ce qui conduit a un manque de reproductibilité.

Pour diminuer sa polarité, il est rendu hydrophobe par fixation pa


r liaison chimique de molécules organiques sur les fonctions sila
nol. Le gel de silice devient alors un support de la phase stationnair
e.

L'oxyde de zirconium ZrO2 , l'oxyde de titane TiO2 ou l'alumine


Al2O3 peuvent remplacer le gel de silice en qualité de support.
La séparation met alors en jeu des coefficients de partage et non de
s coefficients d'adsorption.
Ces phases greffées dont la polarité est ajustable, sont utilisées dan
s la : chromatographie liquide phase greffée .
La plupart des supports à phase greffée sont constitués de
siloxanes:

SiOH + Cl-SiR(CH3)2 Si-O-SiR(CH3)2 + HCl


réaction de silanisation

● Si R = groupement alkyle ou greffon alkyle en C8 (noctyle):– (C


H2)7CH3ou en C18 (noctadecyle): – (CH2)17CH3:
la phase greffée est apolaire.
Plus la chaine est longue, plus le soluté est retenu et plus Tr ↑. La P
M (solvant) est polaire: méthanol, eau. Les solutés polaires sont él
ués en 1er.

● D'autres types de greffons peuvent être greffes sur du gel de sili


ce: des porteurs de fonctions aminopropyle, cyanopropyle... ou d
es greffons dipolaires.
La polarité de la phase greffée augmente.
Fig. Groupements fonctionnels R des organosiloxanes greffés.
Chromatographie d'adsorption ou liquide-soli
de

l'adsorption est un phénomène d'interface : lorsqu'à la su


rface du gel de silice on greffe une monocouche d'hydro
carbure, les molécules, qui présentent une partie lipophil
e et l'autre hydrophile, s'orientent à l'interface.

Les séparations sont basées sur le principe de polarité c'e


st à dire l'existence de dipôles.
● Il existe un mécanisme d'adsorption du soluté par la phase stationnair
e solide et un mécanisme d‘élution (désorption) par la phase mobile liq
uide ou gazeuse.

● Dans le processus d'adsorption sur une surface, les liaisons sont de fa


ible énergie: liaisons hydrogène, dipôle-dipôle ou de van der Waals.

● La PS solide, appelée adsorbant est trés finement divisée.

● La capacité d'adsorption des adsorbants peut être:


faible (carbonate de calcium) ou forte ( silice, alumine, charbon).

● La polarite des adsorbants peut être:


faible (charbon) ou forte ( silice SiO2; silice sous forme hydratee: gel
de silice avec fonctions silanol SiOH; alumine Al2O3, nH2O).

● La PM est constituée d'un mélange de solvants de polarité voisine de


celle des solutés (2 à 4 solvants peuvent être utilisés).
Les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc... jouent
un rôle dans l’affinité qu’ont les molécules pour l’une ou l’autre ph
ase.
Fig. Pouvoir éluotropique (e0) de solvants en chromatographie liq-sol sur alumine
Les solvants
Le tableau précédent donne des valeurs de pouvoir éluotropique de
solvants quand l'alumine est l'adsorbant. Avec un autre adsorbant,
par exemple la silice, l'ordre des pouvoirs éluotropiques reste le m
ême, mais les valeurs sont différentes.

Le solvant ne doit pas réagir chimiquement avec l'adsorbant ni le s


oluté. Il est rare qu'un même solvant puisse permettre l'adsorption
et l‘élution. Des solvants différents sont choisis en fonction des sol
utés a séparer.

Quand l'adsorbant est polaire, le solvant doit être le moins polaire


possible. L‘élution est commencée avec des solvants peu polaires
puis continuée avec des solvants de polarité croissante.
Interactions entre le composé à analyser et les deux p
hases:
• Lorsque les solutés sont neutres, l'ordre d'adsorption s
ur un adsorbant polaire comme le gel de silice ou l'alu
mine est le même que celui présenté pour les solvants
. Les solutés apolaires (ex: alcanes) sont peu adsorbé
s alors que les solutés polaires (ex: méthanol) le sont f
ortement.

• Par contre, on utilisera de préférence l'alumine pour s


éparer des solutés basiques comme les amines et le ge
l de silice pour les phénols et les acides car les solutés
acides sont fortement adsorbés par l'alumine alors que
les solutés basiques le sont par la silice
.
• On parle de chromatographie liquide/solide (LSC) lor
sque l’éluant est un liquide et de chromatographie gaz
/solide (GSC) lorsque l’éluant est un gaz vecteur.
3. Chromatographie d'exclusion stérique ou tamisage mol
éculaire

- filtration sur gel, quand la PS est hydrophile (la PM est un


e solution aqueuse)
- perméation de gel quand la PS est hydrophobe (la PM un s
olvant organique).

Cette technique qui a débuté en 1959, permet de séparer des


macromolecules selon la taille et donc le poids moléculaire (
100 à 10 000 000 daltons).
pores

particules poreuses du gel réticulé de la


PS (polymère réticule en 3 dimensions)
dp = 4 à 300 μm

La PM entraine l'ensemble des molécules. Les molécules de so


luté de petite taille se repartissent dans les pores et a l'extérieur
des pores.
● Les molécules de taille supérieure à celle des pores des
particules ne pénètrent pas. Elles sont "exclues" et éluées
en premier.

● Les molécules de taille < à celle des pores pénètrent. L


eur temps de séjour dans les pores dépend de la dimensio
n des molécules

● La séparation est optimale quand la distribution en taill


e des pores correspond à celle des macromolécules à anal
yser.

● Le solvant pénètre dans tous les pores des particules et


dans le volume interstitiel entre les particules
Le mécanisme d'exclusion stérique est fondé sur l’équilibre ther
modynamique entre deux phases :
- le solvant interstitiel dans le volume mort V0
- le solvant contenu dans le volume poreux Vp.

le volume d’élution Ve d’une macromolécule est défini par :

K=f(taille des particules, taille des pores)


K varie de zéro, pour les grosses molécules exclues du gel (aucun
accès aux pores du gel), à l’unité, pour les molécules en perméati
on totale (accès total au volume poreux).

Les plus grosses sont éluées en premier à V0.


les plus petites sont éluées en dernier à V0 + Vp.
• Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de Sephadex sont total
ement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes, c'est-
à-dire dans la phase mobile (éluant). Elles sortent les premières, à un volume d'élution
Vo appelé volume mort de la colonne.
-Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de Sephadex peuvent p
énétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la col
onne (volume de liquide à l'intérieur des billes ou phase stationnaire + volume de liqui
de à l'extérieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernières, à un volum
e d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
-Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en fonction de
leur taille et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et e
lles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes
• 1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt.
3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo.
2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires et
sont effectivement séparées.

Applications de la chromatographie d'exclusion :


-Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites moléc
ules dans les solutions protéiques : DESSALAGE

-Cette technique est également appliquée au FRACTIONNEMENT de MELANGES de MA


CROMOLECULES et à la DETERMINATION (approximative) de la MASSE MOLAIR
E des protéines. Dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des protéines de
masse molaire connue, tracer la courbe Ve = f(logM), puis effectuer une détermination graphiq
ue.
Le tracé du logarithme de la masse molaire moyenne de divers p
olymères en fonction du volume de rétention (calculé à partir du
temps de rétention expérimental et du débit choisi) permet d'éta
blir la courbe d'étalonnage
4. La chromatographie ionique ou par échange d'ions

C'est une technique de séparation des ions a l'aide de résine


s échangeuses d'ions.

● La PS est constituée d'un support insoluble dans l'eau sur


lequel sont greffes des groupements fonctionnels ionisés. L
a PS échange des ions avec la phase mobile.
Il se crée des interactions dipolaires avec les molécules de s
olutés.

● Plus la charge portée par un soluté est grande, plus le solu


té est retenu par la phase stationnaire.

● La séparation repose sur les coefficients de distribution io


nique entre les deux phases.
● Les échangeurs de cations ont une PS constituée d'un polymère orga
nique greffé avec des groupements acide sulfonique SO3H (acide fort,
fort échangeur de cations) ou acide carboxylique COOH(acide faible, f
aible échangeur de cations): La colonne est appelée cationique.

RSO3- H + (s) + M+ (aq) RSO3- M+ (s) + H+ (aq)

● Les échangeurs d'anions ont une PS greffée avec des groupements a


mmonium: amine tertiaire N(CH3)3+ OH- ou amine primaire
NH3+ OH- : colonne anionique.

RN(CH3)3+OH-(s) + A-(aq) RN(CH3)3+ A-(s) + OH-(a


q)
Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une r
ésine cationique est chargée négativement.

Résine-G- / X+ + cation+ <=> Résine-G- / cation+ + X+


Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une r
ésine anionique est chargée positivement.

Résine-G+ / Y- + anion- <=> Résine-G+ / anion- + Y-


 ► Résines cationiques fortes

Résine sous forme acide : Résine sous forme sodique :


Résine-SO3- / H+ Résine-SO3- / Na+
(contre-ion : H+) (contre-ion : Na+)

► Résines cationiques intermédiaire

Résine-H2PO4- / H+ Résine-H2PO4- / Na+

► Résines cationiques faibles

Résine-COO- / H+ Résine-COO- / Na+


►Résines anioniques fortes

- résines à groupements aminés quaternaires.


- résines à groupements aminés tertiaires.

►Résines anioniques faibles

-résines à groupements aminés secondaires et primaires.


Exemple de résine échangeuse d'ions :

Les résines polyosidiques chargées de type Sephadex :

Ces échangeurs sont utilisés pour la séparation de macromolécules ionisée


s : protéines, acides nucléiques...

Echangeurs anioniques Sephadex :


• Echangeurs cationiques Sephadex :
Capacité de rétention d'un échangeur d'ions

C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la rés


ine peut échanger par unité de masse. On l'exprime pa
r gramme de résine sèche (ou moins souvent par unité
de volume : par ml de résine humide).

Élution

L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de


densité de charge et de concentration plus élevée on u
tilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+
, H+...
• L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs
:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépen


d:
- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution

• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:


- de la charge de cet ion c'est-à-dire :
- de la nature de l'ion (pKa, pHi)
- du pH de la solution
- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est ch
argé, ou/et qu'il est petit)

• de la concentration des ions

• de l'accessibilité des groupements fonctionnels (porosité et granul


ométrie)
Séparation d'anions sur une colonne échangeuse d'anions

Fig. Chromatographie ionique: chromatogramme et instrumentation


diagramme d'ionisation de la glycine
L'instrumentation en HPLC
L'instrumentation de la CLHP comprend:
• un réservoirs : système d'introduction du solvant,
• vanne mélangeuse de solvants,
• pompe, amortisseur de pulsations, contrôleur de débit
• une vanne d'injection dans la colonne qui permet d'introduire la phase mob
ile en haut de la colonne de manière continue sans pulsations et avec un débi
t volumétrique et une pression connues.

L'instrumentation doit permettre l'utilisation de colonnes de différentes dimensi


ons et fonctionnant dans des conditions variables.

Du côté des basses pressions se trouve un détecteur qui doit montrer une grande
sensibilité et une réponse rapide

Le fonctionnement optimal de tous les appareils est obtenu a l'aide d'un contrôle
informatique
Réservoirs

• Un appareil de CLHP comprend un ou plusieurs réservoi


rs, en verre ou en acier inoxydable résistants a la corrosio
n et contenant les solvants.
• Des gaz ambiants comme l'oxygène, peuvent être dissous
dans les solvants, former des bulles dans la colonne et cr
éer des perturbations dans la détection.
• De même des poussières en suspension peuvent perturber
les séparations et gêner le bon fonctionnement des pomp
es et des détecteurs.
Il est donc souhaitable de dégazer et de filtrer les solvants.
L’oxygène est souvent nuisible à l’analyse chromatographique :

• il augmente le risque de dégradation des échantillons et abrège la


durée de vie des colonnes car les phases stationnaires sont facileme
nt oxydables.

• il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le déte


cteur ce qui conduit à un bruit de font important et rend l’analyse i
mpossible.

• il diminue le seuil de détection lors d’une analyse par spectroscop


ie d’absorption à faible longueur d’onde, par fluorimétrie ou par éle
ctrochimie.

• il contribue à la corrosion des pièces en contact avec la phase mo


biles. La corrosion augmentant avec la pression, les pistons et les jo
ints des pompes sont souvent en saphir, agate, Téflon ou en alliages
spéciaux.
Dégazage des solvants HPLC
Un des systèmes de dégazage est basés sur un barbotage de gaz inerte d
ans la phase mobile (de moins en moins utilisé) Après dégazage, le rése
rvoir à solvant doit rester fermé et saturé en gaz inerte pour éviter :

- toute évaporation de solvant pouvant entraîner une modification de co


nstitution de la phase mobile dans le cas de mélange de solvant

- la dissolution dans la phase mobile de vapeur d'eau et de CO2 L'emplo


i d'hélium comme gaz inerte est le plus courant.

Actuellement, la tendance par les constructeurs d'HPLC est l'utilisati


on d'un dégazeur en ligne sous-vide.
Le dégazage de la phase mobile est une opération obligatoire en chromatographie
phase liquide. Il se fait par barbotage d’Hélium dans la phase mobile.
Pompes

Le système de pompage doit:


● Atteindre des pressions élevées: ~200 bars (20 000kPa) ou plus
● Etre exempt d'impulsions
● Imposer des débits reproductibles de 0,1 a 10 ml/min
● Résister à la corrosion et aux solvants.
● Permettre de délivrer un éluant de composition fixe en mode isocra
tique ou de composition variable pour travailler en gradient d‘éluti
on. L‘élution effectuée avec un seul solvant de composition fixe, c
onstante, est appelée "isocratique". La séparation est améliorée par
une élution avec programmation de solvants ou "gradient d‘élution
". Deux ou plusieurs solvants de polarité différente sont utilises. L
es fractions volumiques des solvants sont modifiées selon un progr
amme préetabli.
Injecteurs d'échantillon

● Injecteur à dépôt direct


• L'injection du soluté se fait a l'aide d'une seringue a travers
un septum ( cloison séparant 2 cavités). La reproductibilité
de cette technique est 2 à 3%.

● Vanne à boucle
• Très utilisée. Des pressions de 600 bars peuvent être atteinte
s. Des boucles interchangeables permettent d'injecter des vo
lumes entre 10 et 100 mL. Certaines vannes d'injection ont d
es volumes de boucle de 0,5 à 5 mL et descendent même à 4
0 nL.
La reproductibilité est bonne si la boucle a été complétement remplie.
Etape 1 : Etape 2 :
on remplit la boucle avec l le produit est injecté dans l
a seringue. a boucle.
L’injecteur à boucle
- permet des injections répétées qui donnent des résultats très re
productibles et donc adaptés aux analyses;
- peut supporter des pressions élevées

Injecteur à boucle. À gauche, le remplissage de la boucle. À droite, l’injection dans la colonne


Colonnes
• Elles sont le plus souvent en acier inoxydable ou en verre quand les p
ressions sont < 40 bars.
• Le diamètre intérieur des colonnes conventionnelles varie de ~ 4 à 10
mm, la longueur de ~5 à 30 cm.
• Une colonne trés utilisée a les caractéristiques suivantes :
L = 25 cm, d(intérieur) = 4,5 mm, d(granulométrie) = 5 mm.
nombre de plateaux théoriques: N= 40 000 à 60 000/ mètre

• Il existe des microcolonnes à haute performance et à grande vitesse :


L= ~ 3 à 7,5 cm ; d(intérieur) = ~1 à 4,5 mm,; et d(particules) = ~3
à 5 mm. Elles possèdent jusqu‘à 100 000 plateaux par mètre.

avantages:
- une colonne courte permet de faire des séparations plus rapidement;
- une colonne étroite permet une économie de la phase mobile.
● Colonne de garde (guard column)
Une précolonne courte (0,4 a 1 cm) précède la colonne. El
le est remplie avec la même phase stationnaire et la même
densité de remplissage et elle sert a retenir des impuretés
en provenance de l‘échantillon, de la pompe ou de la vann
e d'injection. La durée de vie de la colonne principale est
ainsi allongée.

● Colonne thermostatée
Les variations de température ont une influence sur les te
mps de rétention.
Les appareils de chromatographie sont alors équipes avec
des dispositifs de régulation qui contrôlent la température
Détecteurs
• Il n'existe pas de détecteur universel comme en chromatographie e
n phase gaz: détecteurs à ionisation de flamme et à conductivité th
ermique.
En CLHP,
• les détecteurs sont spécifiques à chaque application.
• Le volume de détecteur CLHP doit être le plus faible possible afin
de diminuer l‘élargissement des bandes.
• Il existe des détecteurs de propriétés de la phase mobile qui dépen
dent de la présence d'un soluté: indice de réfraction, constante diél
ectrique, densité.
• Et des détecteurs de propriétés du soluté, que ne possédent pas la p
hase mobile: absorbance dans l'ultraviolet, fluorescence ou courant
de diffusion,…
• Détecteurs d'absorption dans UV-Vis
• Détecteurs d'absorption dans l'infrarouge
les larges bandes d'absorption de l'eau et des alcools empêchent l'utilisa
tion de ce détecteur infrarouge
dans de nombreuses cas.
• Détecteurs de fluorescence
• Détecteurs réfractométriques
Ils mesurent la différence d'indice de réfraction entre la phase mobile et
la phase mobile avec l‘échantillon. Ils nécessitent une température ré
gulée a 0,01°C, car les indices de réfraction varient avec la températ
ure.
• Détecteurs électrochimiques
Leur fonctionnement est base sur l'ampéromètrie, la polarographie, la c
oulomètrie et la mesure de conductivité.
• Détecteurs par spectrométrie de masse
Techniques de multidétection
La détection est souvent multiple avec couplage:
• spectroscopie UV / réfractométrie;
• réfractométrie/diffusion de la lumière;
• réfractométrie/viscosimétrie;
• diffusion de la lumière multiangles / viscosimétrie
La chromatographie en phase liquide sur colonnes est devenue un outil analytique perfo
rmant utilisé dans des domaines variés allant de l'analyse de fluides biologiques à celui
des produits pétroliers lourds.

Ce développement est dû à la fois à une meilleure compréhension des mécanismes d'int


eraction aux grandes efficacités obtenues avec des phases stationnaires de plus en plus f
ines (3 mm) et enfin aux progrès importants effectués dans le domaine de l'appareillage,
en particulier pour la détection.

La CPL se présente ainsi comme une méthode de séparation complémentaire de la chro


matographie en phase gazeuse (CPG) pour l'analyse de solutés peu volatils ou thermodé
gradables (cas de la majorité des molécules thérapeutiques). Elle se distingue de la CPG
par la variété des phases stationnaires et partant des interactions mises en jeu et par une
température moins élevée, ce qui accroît la force de ces interactions et augmente la séle
ctivité.

En revanche, la CPL est une méthode de mise en œuvre plus délicate que la CPG ; de pl
us, malgré les progrès récents, elle souffre encore de l'absence de détecteurs aussi sensi
bles et universels que la détection à ionisation de flamme de la CPG.
Les grandeurs de rétention
Temps de rétention
C’est le temps que met le soluté à sortir de la colonne c’est à dire le temps éco
ulé entre l’injection et le maximum du pic du composé élué. C'est la principal
e grandeur de rétention.
Il est noté tR (en minutes)
Il varie en fonction du débit, de la température d'élution, de la composition de
la phase mobile et du vieillissement de la colonne.

Temps mort
Il est noté tM ou t0 (en minutes)
C'est le temps que met un soluté non retenu à sortir de la colonne.
En HPLC, c'est également le temps mis par la phase mobile (l'éluant) pour trave
rser la colonne.

Temps de rétention réduit


On ne prend plus comme origine l’injection mais le pic du temps mort.
Il est noté t'R et est égal à t'R = tR-tM
Le volume de rétention
Le volume de rétention Vr correspond au volume de phase mobile
nécessaire pour éluer le produit S. Si D est le débit de la phase mo
bile (D supposé constant) :

Vr = tr * D.
Le volume mort.
On appelle volume mort Vm le volume de phase mobile qui pass
e à travers la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de la c
olonne (pendant le temps tm). Autrement dit, Vm est le volume
occupé par la phase mobile dans une colonne.
Vm = tm * D.

Volume et temps de rétention réduits


On appelle volume de rétention réduit V'r, la différence entre les terme
s Vr et Vm.
V'r = Vr - Vm
Le facteur de rétention (ou de capacité).
Le facteur de rétention k' pour un produit donné est défini comme
suit :
ou également

Ce qui donne : Vr = Vm(1 + k’) et tr = tm(1 + k’)

c'est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire s


ur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobil
Le facteur de sélectivité a

Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension, est égal


au rapport des facteurs de capacité de deux solutés dont on veut ré
aliser la séparation. Il s’exprime comme ceci :
La résolution R
La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation.
Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics:
a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2 - tr1;
b) la largeur des pics à la base l.
R= 2(tR(2)-tR(1))/(ω1+ ω2)
25,00 25,00

20,00 20,00

15,00 15,00

10,00 10,00

5,00 5,00

0,00 0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bonne résolution R>1 Mauvaise résolution R<1


- Pour des valeurs de R supérieures à 1,5, les pics sont correctement séparés.
- On peut optimiser le facteur de résolution en modifiant les débits, les tem
pératures ou en changeant de type de colonne.
Le nombre de plateaux théoriques N
C’est un paramètre qui sert à mesurer la performance d’une colonn
e à distillation fractionnée

l = largeur du pic à la base w = largeur du pic à mi-hauteur

La hauteur équivalente à un plateau théorique h est :

où LC = longueur de la colonne
et N = nombre de plateaux théoriques

Pour des colonnes de même longueur, celles où les équilibres se réalisent le plus rapide
ment sont celles où le nombre de plateaux théoriques est le plus élevé ou sont celles don
t les HEPT sont les plus basses.
Le nombre de plateaux théoriques N
C’est un paramètre qui sert à mesurer la performance d’une colonn
e à distillation fractionnée

N= 16 Tr2/ω2 = 5,54 Tr2/ d2

La hauteur équivalente à un plateau théorique h est :

où LC = longueur de la colonne
et N = nombre de plateaux théoriques

Pour des colonnes de même longueur, celles où les équilibres se réalisent le plus rapide
ment sont celles où le nombre de plateaux théoriques est le plus élevé ou sont celles don
t les HEPT sont les plus basses.
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

En chromatographie gazeuse (CPG), la phase mobile est toujours un gaz (le plus
fréquemment N2, H2, He).

La phase stationnaire est souvent un liquide très visqueux recouvrant la paroi i


nterne des colonnes capillaires

Le flux du gaz vecteur (phase mobile) sert à transporter les constituants, tandis que
la séparation s’effectue au contact de la phase stationnaire.

La qualité de la séparation (la résolution) dépend du temps de séjour des constitua


nts dans la phase stationnaire et de la fréquence de leur interaction avec cette pha
se (sélectivité).

La nature des interactions entre le constituant et la phase (sélectivité) est détermin


ée par des groupes fonctionnels. La polarité de la phase stationnaire dé- pend de s
es substituants.
La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire
et une phase mobile gazeuse. La séparation des analytes repose sur la différence
d’affinité de ces composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire.

Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renferm
ant une substance liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le tra
nsport se fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé « gaz vecteur », qui constitue la phase
mobile.

A(phase stationnaire) ⇄ A(phase mobile).

Plus la molécule a d’affinité pour la phase stationnaire, moins elle est entraînée par le
gaz vecteur et donc plus elle est retenue sur la colonne. Ainsi, sur colonne polaire, le
s analytes apolaires sortent en premier, alors que sur colonne apolaire, les analytes p
olaires sortent en premier.

Par ailleurs, plus la température est haute, plus on déplace l’équilibre de partag
e vers A(phase mobile), et donc plus l’analyte A est entraîné par le gaz vecteur.
Chromatogramme d’un mélange d’alcanes (© Sigma-Aldrich)

colonne : SLB-5ms, 30 m x 0,25 mm I.D., 0,25 μm


température du four : constante et égale à 45 °C pendant 3 min, puis
variant de 20 °C/min jusqu’à 360 °C pendant 10 min
température de l’injecteur : 275 °C
temperature du détecteur : FID, 365 °C
gaz vecteur : hélium, avec débit constant de 1,3 mL/min.
injection : 1.0 μL, 100:1 split
échantillon : TPH Mix 3, chaque analyte ayant une concentration de 10
00 μg/mL en solvant disulfure de carbone
Schéma de principe d'un appareil chromatographie en phase gazeuse
Description d'un chromatographe.
L'injecteur

Cette opération est faite


- à l’aide d’une micro seringue - pour les liquides et les solutions
- à l’aide d’une vanne à boucles - pour les mélanges gazeux
- La température de l'injecteur sera toujours supérieure d'environ 20°C à la tempér
ature d'ébullition du composé le moins volatil du mélange à étudier.

- L'injection de la solution se fera à l'aide d'une micro seringue (quelques µl ) elle


sera franche et rapide pour éviter les phénomènes de traînées (1 µl dans le cas de c
olonnes capillaires). On pique au travers du septum, afin que l’extrémité de l’aigui
lle arrive au-dessous du niveau de l’arrivée du gaz porteur, puis on pousse le pisto
n pour réaliser l’injection
Certains injecteurs peuvent êt
re munis d’une fonction « Spli
t/Splitless ».

La fonction « split » permet d


e ne pas injecter la totalité de
l’échantillon ; cela peut être ut
ile dans le cas d’échantillon e
n solution concentrée, pour é
viter de surcharger la colonne
Schéma d’un injecteur
Les injecteurs en CPG sont de 2 types
:

- avec diviseur (Split)


- ou sans diviseur de flux (s
plitless).

Les injecteurs à diviseurs de flux perm


ettent d’injecter de très faibles volumes
ce qui permet de ne pas saturer la colo
nne (cas de fortes concentrations).

Le split correspond à un ratio entre la


partie réellement injectée dans la colo En mode splitless, la vanne de fui
nne et celle dirigée vers l'extérieur de l' te est fermée pendant l’injection (
appareil. de 30 secondes à 1 minute), le so
lvant et le soluté sont piégés en tê
Le mode splitless est recommandé po te de colonne grâce à une faible t
ur la détection de traces (faibles conce empérature de four. L’augmentati
ntrations). on de la température du four per
met ensuite d’éluer les composés
et le solvant qui sort le 1er.
Mode de fonctionnement split

- Une fraction de l’échantillon pénètre dans la colonne


- Pour fortes concentrations
- Volatilisation rapide: pics étroits
Avantages de la division

-Faible quantité de soluté sur la colonne


-Temps de transfert sur la colonne est réduit

Mode de fonctionnement splitless


-Injection lente
-La fuite est fermée (ouverte pour purger)
-Pour les faibles concentrations
Colonne
C'est l'organe principal. Elle est constituée d'un tube généralement métallique de dia
mètre intérieur de l'ordre du millimètre.
Ce tube contient la phase stationnaire constituée souvent par un liquide adsorbant fi
xé sur un solide inerte
On distingue 2 types de colonne:
- colonne remplie
-Colonne capillaire

Colonne remplie Colonne capillaire


Colonne capillaire
Les colonnes capillaires sont de simples tubes d’acier inoxydable, de verre ou de si
lice fondue (matériau inerte vis-à-vis de la phase stationnaire et des échantillons) de
diamètre intérieur compris entre 0,1 et 0,5 mm, et d’une longueur typique de plusi
eurs dizaines de mètres, pouvant aller jusqu’à 100 m.

Pour tenir dans l’appareil, la colonne est enroulée, avec des spirales ayant 10 à 30 c
m de diamètre.

La surface interne de ce tube est recouverte d’un film de 0,1 à 5 µm d’épaisseur cons
titué de la phase stationnaire.

Ce film est mis en place par greffage ou simple déposition, le greffage étant générale
ment préféré pour des raisons de stabilité thermique.

Par exemple, la Carbowax® est une colonne capillaire comportant un film polaire de
polyéthylène glycol greffé en surface, film qui constitue la phase stationnaire.
La SE-30® est une colonne capillaire apolaire comportant un film de polydiméthylsilo
xane qui constitue la phase stationnaire.
Illustration des phases stationnaires polaire Carbowax® (en haut)
&
apolaire SE-30 (en bas), greffées sur la surface interne du tube capillaire en silice fondue.
3 types de colonnes capillaires:

WCOT : Wall Coated Open Tubular PLOT : Porous Layer Open Tubular

Tube ouvert à paroi


Tube ouvert à couche poreuse
recouverte d' un film
où la phase stationnaire est un
liquide greffé ou non
solide poreux non imprégné
SCOT : Support CoatedOpen Tubular

Tube ouvert à support imprégn


é
où la phase stationnaire est un
solide imprégné de liquide
Les avantages principaux des colonnes capillaires % aux colonnes remplies sont :

-très grande efficacité,


-analyses plus rapides,
-meilleure limite de détection.

Cependant, si les avantages sont importants, il y a aussi quelques inconvénients :

-très faible capacité d'échantillonage (volume introduit 10 fois plus faible,


proche de 0,1 microlitre) d'où...
-nécessité de détecteurs très sensibles
-techniques d'injection spéciales
Colonne remplies ou à garnissage
Caractéristiques des colonnes remplies:
- diamètre interne : 1/8" (3,2 mm) ou 1/4" (6,4 mm)
- longueur : 0,5 à 3 mètres
- tube :
acier inoxydable - assez inerte et bon conducteur de chaleur
verre - inerte mais mauvais conducteur de chaleur
Garnissage pour chromatographie gaz-solide
granulé polymérique de gel de silice traitée à très haute température ou par un procédé hydrot
hermique par lequel il est possible d'obtenir des pores de dimensions voulues. La surface de ce
matériel poreux peut atteindre 500 m2/g.
polymère organique du type éthylvinylbenzène-divinylbenzène qui possèdent des pores dont l
e diamètre varie de 0,0075 a 0,8 mm.

Garnissage pour chromatographie gaz-liquide


support solide poreux et inerte imprégné d'un liquide non volatil appelé phase stationnaire qui
peut être de nature diverse .
nature du support - surtout gel de silice
- peut être actif s'il possède beaucoup de groupements -Si-OH libres
- peut être désactivé par réaction avec le dichlorodiméthylsilane ou le diméthylsilazane.
- lavé à l'acide pour enlever les oxydes métalliques, en particulier les oxydes de fer
- lavé par une base pour permettre la chromatographie de substances basiques.
Les techniques colonnes remplies et colonnes capillaires sont complémentaires : les colo
nnes remplies sont moins coûteuses et sont mieux adaptées à l'analyse en ligne. Les colo
nnes capillaires permettent des séparations impossibles avec des colonnes remplies et pe
rmettent aussi des analyses rapides.
Le four

La colonne est contenue dans un four de type chaleur tournante, dont la température
est précisément ajustable (typiquement entre 20 °C et 350 °C) et programmable.

Les températures utilisables en pratique dépendent des domaines de stabilité en tem


pérature de la colonne utilisée, et de ceux des composés analysés.

Plus la température du four (et donc de la colonne) est élevée, plus les analytes se d
éplacent rapidement dans la colonne, mais moins ils interagissent avec la phase stati
onnaire, et donc moins les analytes sont séparés.

Plus la température du four est basse, meilleure est la séparation des analytes mais p
lus longue est l’analyse. Le choix de la température est donc un compromis entre la d
urée de l’analyse et le niveau de séparation désiré.
Une méthode pour laquelle la température est gardée constante tout au long de
l’analyse est appelée « isotherme ».

A l’inverse, on peut choisir d’augmenter la température du four au cours de l’a


nalyse : cette méthode est appelée « gradient ».

D’une manière générale, une méthode isotherme tend à donner des pics larges
pour les espèces les plus retenues, et donc une moins bonne séparation.

Ce phénomène est partiellement dû à la diffusion : plus une espèce chimique cir


cule longuement dans la colonne, plus elle a le temps de diffuser, élargissant ain
si le pic, et donc diminuant la hauteur des pics par la même occasion.
Figure 6

chromatogrammes d’un mêm


e échantillon réalisés dans dif
férentes conditions :

(a) avec une méthode isothe


rme à 45 °C ;

(b) avec une méthode isother


me à 145 °C ;

(c) avec une méthode utilisan


t un gradient de température
de 30 °C à 180 °C sur 30 min
utes.
Détecteurs en CPG
-Catharomètre
• Le détecteur le plus utilisé en CPG est celui à conductibilité thermique appelé cath
aromètre. Sa température est généralement la même que celle de l'injecteur. Il est à
réponse universelle, mais relativement peu sensible.
• Il est fondé sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emporté par le
gaz vecteur pur et le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur chargé des molécul
es de soluté.
• la conductibilité thermique du gaz vecteur (qui traverse le détecteur) varie chaqu
e fois qu’un constituant X traverse le détecteur.

Caractéristiques:
- moyennement sensible;
- non destructif;
- économique et d'entretien facile;
- sensible aux changements de tem
pérature et de débit
- Détecteur à ionisation de flamme (FID)

C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais moins


universel, car il ne donne de réponse qu’aux composés organiques

Il a aussi l’inconvénient, contrairement au catharomètre, de détruire le solu


té qui le traverse, car son principe est de brûler, dans une flamme d’hydrog
ène, l’effluent apporté par de l’azote (gaz vecteur).

Sous l’effet d’un champ électrostatique, il se forme des ions carbone de charge positive qui sont
précipités sur une électrode où ils créent un courant d’ionisation que l’on amplifie grâce à un é
lectromètre amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient par conséquent un signal proportionn
el au débit-masse du soluté dans le détecteur
Caractéristiques du FID:
- très sensible;
- montre une réponse linéaire en fonction de la masse de soluté;
- sensible aux changements de température et de débit;
- non sélectif - universel;
- destructif - les substances sont brûlées.
-Détecteur à capture d’électrons
Une source telle que le tritium (3H) ou le (63Ni) envoie des électrons libres dans le détecteur.
Quand ce détecteur est traversé par des substances ayant une affinité pour les électrons libre
s, il se produit des ions qui, comme pour le détecteur à ionisation de flamme, dans le champ
électrostatique existant, sont recueillis par une électrode et forment un courant d’ionisation
à amplifier convenablement.

-Détection par spectroscopie infrarouge


-Détection par spectrométrie de masse
Le couplage du chromatographe et du spectromètre de masse est simplifié du fait de la n
ature de la phase mobile qui est gazeuse. Le problème réside dans les différences de pres
sion qui existent entre les deux appareils ; le chromatographe fonctionnant à pression at
mosphérique et le spectromètre de masse sous un vide très poussé. Pour maintenir ce vid
e dans les cas où le débit est relativement grand et pour éviter que le vide se fasse dans la
colonne, on intercale un séparateur à jet moléculaire
 CPG :
- applicable aux substances volatiles ou volatilisables par élévation de T°
- non applicable aux substances ioniques ou de MM>300 car non volatiles
- non applicable aux substances thermolabiles
- mais existence d’un détecteur universel de faible coût (ionisation de flam
me )

 CLHP :
- tous types de substances (ioniques ou non ,thermolabiles ou non )
- condition : composé soluble dans PM
- manque de détecteur universel de faible coût
Analyse quantitative
A chaque méthode d’analyse est associée une méthode de quantification et de cal
cul propre à la méthode.

Globalement, on peut dissocier les méthodes de quantification en deux familles :

Les méthodes absolues

- Les méthodes directes


- Les méthodes directes impliquant l’application d’une loi
- Les dosages chimiques

Les méthodes comparatives (cas : chromatographie ; Absorption atomique)

- L‘étalonnage externe
- L’étalonnage interne
- La méthode des ajouts dosés
Les méthodes comparatives
Le concept d’une méthode comparative d’analyse consiste à comparer une valeur in
duite (bien souvent un signal électrique) à une échelle externe.

Le premier avantage de ces techniques comparatives est de s’affranchir d’un certai


n nombre de paramètres de réglage des appareillages. En effet, dans tous les cas,
on va mesurer un signal électrique ou un signal optique d’amplitude faible qui sera a
mplifié , d’où un réglage d’un gain optimum qui peut conduire à des réglages différe
nts en fonction des paramètres physiques

Par les techniques comparatives, on s’affranchit de ces paramètres que l‘on peut qu
alifier d’internes à la machine. On fera toutefois attention de ne pas les modifier en
cours d’analyse

En fonction des paramètres maîtrisés par l’opérateur, cette technique se décline en


trois sous-ensembles : l’étalonnage externe, L’talonnage interne et
La méthode des ajouts dosés
Méthode d’étalonnage externe

 Simple à mettre en œuvre (et donc très répandue)

 Conditions d’utilisation: maîtrise des paramètres


-longueur du chemin optique (absorption moléculaire, atomique…
)
- maîtrise du volume injecté dans le cas de la chromatographie (In
jection en boucle de volume constant appliquée en HPLC..).

 Etapes de réalisation:

-Réalisation d’une courbe d’étalonnage à partir de solutions de co


ncentrations connues
-Mesure du paramètre sur l’échantillon inconnu
-Comparaison de la mesure à la courbe d’étalonnage.
Application en chromatographie:

Basée sur la comparaison des aires (ou hauteurs) des pics de l’échantillon i
nconnu / gamme étalon de l’analyte, cette méthode permet de doser au moins une es
pèce (P) dans un mélange et s’emploie lorsque le volume injecté est précis:

- En HPLC ; Il faut que :


- le volume de boucle d’injection soit correctement calibré (source d
’erreur : appareil)
- et qu’aucune bulle d’air n’y ait été placée (source d’erreur : opérat
eur).

- En CPG ; Il faut que :


- le volume de liquide présent dans la seringue soit correctement es
timé (source d’erreur : précision de la seringue, opérateur).

Important:
 les chromatogrammes étalons doivent avoir des compositions proches des chrom
atogrammes échantillons.
 La relation est déduite d’une loi de proportionnalité masse / surface qui doit être v
érifiée et validée sur l’appareil utilisé.
Il est nécessité de se trouver dans un domaine de linéarité, ce qui doit aussi être v
érifié et validé.
Dosage par étalonnage interne
Il arrive des fois ou il n’est pas possible de maintenir constant un paramètre de l’analy
se (Exple: En CPG quand on ne connaît pas précisément le volume d’échantillon inje
cté dans le chromatographe).

Dans ces cas, on s’affranchit de cette méconnaissance en introduisant, dans l’échanti


llon à analyser une substance (étalon) en quantité connue.

Principe:

Le principe consiste à comparer les surfaces des pics du mélange avec un étalo
n pris comme référence.
On réalise 2 chromatogrammes :
-le 1er pour déterminer les coefficients de proportionnalité,
-le 2nd pour le dosage.

On réalise le 1er mélange avec des concentrations connues en élément à doser a


uquel on rajoute l’étalon.
On a :

- me = KeAe
- m1 = K1A1
- m2 = K2A2

m1/me = K1/Ke . A1/Ae m1/me = K1/e. A1/Ae

Tout étant connu, on peut déterminer K1/e = K1/Ke qui est le coefficient de proportio
nnalité relatif de 1 par rapport à "e".

Pour le dosage, on ajoute un volume connu d’étalon au mélange à analyser. Le ch


romatogramme obtenu permet d’en déduire les fractions massiques du mélange.

m’i/m’e = Ki/e A’i/A’e

Le choix de l’étalon est essentiel :

 Ne pas se trouver dans l’échantillon


Etre distinguable des analytes cibles
Avoir des propriétés physiques et chimiques proches
Méthodes des ajouts dosés

 Méthode simple et facile à mettre en oeuvre.


 Utilisée surtout pour des analyses de traces d’éléments métalliques et / ou de p
olluants.
 Elle est basée sur une double détermination d’un soluté inconnu :
- Une première détermination sur l’échantillon brut
- Une seconde détermination sur l’échantillon dopé

Application à la chromatographie :

Soit un échantillon contenant une masse m°1 de soluté à analyser. On lui ajoute u
ne masse m°e de standard interne, comme dans le cas de l’étalonnage interne et
on procède à l’injection chromatographique.

On obtient deux aires A1 et Ae pour ce premier échantillon :

m°1/ m°e = K1e A1 / Ae


A l’issue de cette première injection, on ajoute une masse m°1’ connue de soluté à a
nalyser à l‘échantillon précédent et on procède à son injection chromatographique.

On obtient alors deux nouvelles aires A’1 et A’e pour le soluté et le standard interne

(m°1 + m°1’) / m°e = K1e A’1 / A’e

le rapport des deux expressions donne:

m°1 / (m°1 + m°’1) = (A1 / Ae) / (A’1 / A’e)

m°’1 ( A1 / Ae)
Soit : m°1 = 
[ (A’1 / A’e) – (A1 / Ae)]
Conclusion

Toutes les techniques analytiques mettant en œuvre des techniques spec


trales font appel à des méthodes de quantification basées sur un étalonna
ge externe, si les paramètres, autres que la concentration, sont maîtrisés.

Dans tous les autres cas, on aura recours à des techniques d’étalonnage
interne