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Les Bacilles Gram Négatifs Exigeants:

Les Genres Bordetella, Haemophilus, Brucella,


Legionella.

Présenté par Dr S. Kara Slimane,


Maitre-Assistante en Microbiologie,
EPH Mostaganem,
Laboratoire Central.
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karasamia5@gmail.com
Le Plan:

Le Genre Bordetella: Le Genre Haemophilus:


Généralités. Caractères Généraux.
Habitat et Pouvoir pathogène. Habitat.
Les Prélèvements. Pouvoir Pathogène.
Transport. Etude Bactériologique.
Culture. Sensibilité aux Antibiotiques.
Les Caractères Biochimiques. Autres Haemophilus.
La Biologie Moléculaire.
La Sensibilité aux Antibiotiques.

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Le Genre Bordetella:
A. Généralités:

Le genre Bordetella regroupe une espèce strictement humaine ( B. pertussis ) et des


espèces retrouvées à la fois chez l'homme et l'animal ( B. parapertussis,
B. bronchiseptica, B. avium, B. hinzïï, B. holmesïï et B. trematum)
ainsi qu'une espèce de l'environnement retrouvée très rarement chez l'homme
( B. petrii ).
Les bactéries du genre Bordetella pathogènes pour l'homme sont classiquement de
petits coccobacilles à Gram négatif à coloration bipolaire, immobiles à l'exception
de B. bronchiseptica .
B. pertussis est très court (0,2-0,3 μ m X 0,5-0,8 μ m) et immobile,
d'autres espèces peuvent être plus longues (1-2 μ m) voire devenir filamenteuses
lors des repiquages.

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Le Genre Bordetella:

B. Habitat et pouvoir pathogène: (1)


Deux espèces de bordetelle sont responsables de la coqueluche, B. pertussis qui est
strictement humain et B. parapertussis.
La durée des symptômes est moins longue pour la deuxième espèce.
B. parapertussis est aussi retrouvée chez les ovins.
B. bronchiseptica peut être pathogène pour des hommes fragilisés tels que des
immunodéprimés de plus de 45 ans atteints de symptômes respiratoires et souvent
fumeurs. Cette espèce se retrouve chez de nombreuses espèces animales.
B. holmesïi est de plus en plus isolées, cette espèce est responsable de bactériémies
survenant généralement chez des patients aspléniques ou drépanocytaires.
D'autres espèces telle que B. avium, B. hinzïï, B. trematum et B. petrii sont
rarement rencontrées, ce sont des germes opportunistes.

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Le Genre Bordetella:

B. Habitat et pouvoir pathogène: (2):

Depuis quelques années, en l'absence de rappel vaccinal, la transmission de B.


pertussis ne se fait plus d'enfant à enfant, mais d'adultes ou d'adolescents à des
nourrissons non vaccinés.
L'expression clinique de la coqueluche, qui est une maladie très contagieuse, est
très variable selon les sujets et on distingue :
• la forme classique typique de l'enfant qui comporte 3 phases après une incubation
de 7 à 10 jours :
– Phase catarrhale (1 à 2 semaines) avec des signes non spécifiques d'infection des
voies aériennes supérieures et une très grande contagiosité ;
– Phase paroxystique (4 à 5 semaines) quintes de toux, reprises inspiratoires sonores
(chant du coq), vomissement, cyanose et possibles complications infectieuses ;
– Phase de convalescence (plusieurs semaines voire plusieurs mois).
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Le Genre Bordetella:

B. Habitat et pouvoir pathogène: (3):

• la forme du petit nourrisson (< 6 mois) peut se traduire par une détresse
respiratoire avec défaillance polyviscérale et hyperlymphocytose majeure.
Cette pathologie peut être grave voire mortelle.
• la coqueluche de l'adulte est souvent méconnue, elle est très fréquente et doit être
évoquée devant une toux persistante durant plus d'une semaine.
Les autres bordetelloses se présentent sous forme de manifestations respiratoires,
bactériémiques, voire localisées tel que auriculaires ou à type de surinfections de
blessures.

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Le Genre Bordetella:

C. Les Prélèvements:

Devant une suspicion de coqueluche, le prélèvement biologique doit être réalisé le


plus précocement possible, on recommande chez le nourrisson l'aspiration
nasopharyngée douce à l'aide d'une sonde molle et fine.

Chez les adolescents ou les adultes, une personne entraînée peut réaliser un
prélèvement naso-pharyngé à l'aide d'un écouvillon en dacron.

Les Bordetella autres que B. pertussis et B. parapertussis sont isolés à partir de


divers prélèvements et sont assez souvent des découvertes fortuites car sans
éléments cliniques d'orientation préalables.

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Le Genre Bordetella:

D. Transport:

B. pertussis est très fragile et le prélèvement doit être acheminé immédiatement au


laboratoire.
Le biologiste doit avoir été prévenu afin de préchauffer des milieux de culture pour
ensemencer le prélèvement sans délai à son arrivée, moins d'une demi heure après
qu'il soit réalisé.
Un milieu de transport Amies® avec charbon peut être utilisé si l'acheminement du
prélèvement au laboratoire est trop long.

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Le Genre Bordetella:

E. Culture: (1)

Elle doit être tentée systématiquement (spécificité 100 %) dans les 3 premières
semaines de la maladie avec la sensibilité de 50–60 % durant la 1ère semaine de
toux.
La culture se fait en aérobiose et en atmosphère humide sur milieux spéciaux
spécifiques des Bordetelles à base de pomme de terre :
milieux solides de Bordet-Gengou (BG) ou de Regan-Lowe.
La température d'incubation est de 35–36 °C et les premières colonies
hémolytiques n'apparaissent qu'entre 3 et 7 jours.
Celles-ci sont classiquement en « gouttelettes de rosée »
Le diagnostic d'orientation repose sur des tests assez simples et peut être confirmé
par un test d'agglutination sur lame avec un anti-sérum pour B. pertussis.
La viabilité des Bordetelles est très faible à l'exception de B. bronchiseptica.
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Le Genre Bordetella:

Culture: (2)

L'antibiogramme est rarement pratiqué, mais il faut noter que les β -lactamines
n'ont pas d'efficacité sur B. pertussis , les macrolides sont les molécules les plus
utilisées pour traiter les infections.
Elle doit être réalisée systématiquement (spécificité 100 %) dans les 2 premières
semaines de la maladie même si la sensibilité n'est que de 50–60% durant la 1ère
semaine de toux, période la plus sensible.
La culture se négative en 3 à 5 jours après un traitement par macrolides, délai
variable selon la molécule utilisée.

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Le Genre Bordetella:

Culture: (3):

Un résultat de culture négative ne peut être rendu qu'après 10 jours.


A noter que toute souche de Bordetella isolée doit être adressée au centre national
de référence de la Coqueluche et autres Bordetelloses.
Ces envois permettent au CNR d'étudier la sensibilité des souches aux
antibiotiques, de rares souches résistantes à l'érythromycine ont été décrites aux
États-Unis, ainsi que le polymorphisme des facteurs de virulence avec la récente
description de souches n'exprimant pas la toxine pertussique ou la pertactine.

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Le Genre Bordetella:
B. pertussis B. parapertusis
Délai de croissance sur Bordet 3-5jr 2 jrs
Gengou
Croissance sur gélose au sang - +
mobilité - -
oxydase + -
uréase - +
Nitrate Réductase - -

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Le Genre Bordetella:

Recherche de constituants bactériens sans culture par PCR (polymérase chain


réaction):
L'ADN bactérien est recherché par PCR point final ou par PCR en temps réel pour
porter le diagnostic de coqueluche et/ou de Bordetella directement sur produit
pathologique, prélevé dans les mêmes conditions que pour la Culture.
Différentes cibles peuvent être utilisées :
• le promoteur du gène codant la toxine de pertussis :
une seule copie par génome, spécifique de B. pertussis avec une sensibilité de 65 à
80% ;
• des séquences d'insertion (IS), présentes en multi copies, de 10 à plusieurs
centaines induisant une meilleure sensibilité, 80 à 100% selon les études.
– IS 481 , permet la détection de B. pertussis et B. holmesii , et celle de B.
bronchiseptica ;
– IS1001, permet la détection de B. parapertussis et B. bronchiseptica dans certains
Cas. 13
Le Genre Bordetella:
la PCR:
La PCR permet de détecter le génome sur une période de trois-quatre semaines
après le début de la toux.
La positivité de la PCR ne saurait préjuger de la viabilité du germe.

Elle est recommandée chez toute personne ayant des signes cliniques depuis moins
de 3 semaines.

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Le Genre Bordetella:
Diagnostic indirect : sérodiagnotic:

La sérologie n'a d'intérêt qu'après 4 à 5 semaines de toux chez une personne non vaccinée
depuis trois ans afin de pouvoir l'interpréter correctement.
les anticorps n'apparaissent véritablement qu'après 4 à 5 semaines de toux avec un pic à 5 à 6
semaines et leur progression à l'exception du pic est parallèle à celle d'une personne vaccinée
depuis moins de 3 ans.
Elle ne doit donc jamais être réalisée chez les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants, elle
était possible chez les adolescents et adultes après avoir correctement évalué l'intérêt de cette
prescription.
La technique de référence est la détection par technique ELISA d'IgG anti-toxine Pertussis (PT)
spécifique de B. pertussis dans le sérum.
Actuellement, aucun kit commercial n'est validé en France et seul le CNR la pratique.
Lorsque la sérologie est faite à bon escient, elle peut être rendue positive si le taux d'anticorps
anti-PT est élevé (>100 U par ELISA) ou s'il existe une vraie augmentation du taux (x4) entre deux
sérum prélevés à 3–4 semaines d'intervalle, résultats rarement obtenus en réalité.
Par contre, depuis la parution du Journal Officiel du 15 février 2010, la sérologie de B. Pertussis
n'étant plus à la nomenclature, elle ne doit plus être réalisée mais remplacée quand cela est
possible par une PCR pour une recherche simultanée de B. pertussis et parapertussis. 15
Le Genre Bordetella:

Sensibilité aux antibiotiques (1):

L'antibiogramme n'est pratiqué que par le CNR, mais il faut savoir que les infections
à B. pertussis sont traitées par les macrolides.
De rares souches de B. pertussis résistantes à l'érythromycine ont été décrites aux
USA, la plupart des fluoroquinolones sont très actives, tandis que les β -lactamines
sont sans action.
B. parapertussis est généralement moins sensible que B. pertussis.
Quant aux autres Bordetella, elles ont des sensibilités comparables aux autres
bacilles à Gram négatif non fermentant.
Il faut rappeler que l'épidémiologie de la coqueluche s'est complètement
transformée avec la vaccination.

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Le Genre Bordetella:

Sensibilité aux antibiotiques (2):

Les vaccins « acellulaires existent actuellement.


Six protéines sont actuellement bien connues et susceptibles d'induire une
protection chez l'homme ; ces antigènes sont la toxine de pertussis (PT), l'adenyl
cyclase-hémolysine (AC-Hly) et les adhésines telles que l'hémagglutinine
filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN) et les fimbriae (FIM).
Tous les vaccins contiennent au moins la PT et certains une ou plusieurs adhésines
(FHA, PRN ou FIM).
Il n'existe pas de vaccin anticoquelucheux seul, il est toujours combiné à différentes
valences, diphtérie, tétanos, poliomyélite, H. influenzae b ou hépatite B, la formule
variant selon les spécialités.

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Le Genre Haemophilus:

A. Caractères généraux:

• Les Haemophilus sont de petits bacilles à Gram négatif, aérobies-anaérobies


facultatifs, immobiles, non sporulés, qui exigent pour leur croissance un ou deux
facteurs présents dans le sang et dans les tissus animaux :
Le facteur « V » (lettre « v » majuscule), thermolabile est le coenzyme 1 ou
Nicotinamide- Adénine-Dinucléotide (N.A.D.).
Le facteur « X » (lettre « x » majuscule) ou hémine, thermostable est une
ferroprotoporphyrine.

Plusieurs Haemophilus sont pathogènes pour l'homme. Le principal est


Haemophilus influenzae.

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Haemophilus influenzae:

B. Habitat:
Découvert en 1892 par PFEIFFER qui pensait avoir trouvé l'agent de la grippe,
H.influenzae est un commensal de l'arbre respiratoire supérieur, au moins sous sa
forme non capsulée. La forme capsulée de type b, la plus pathogène, pourrait être
parasite strict de l'espèce humaine et transmise par voie respiratoire.
C. Pouvoir pathogène:
• Chez le jeune enfant :
H.influenzae provoque des rhinopharyngites qui peuvent se compliquer de
sinusites et d'otites (H.influenzae est l'agent le plus fréquent des otites moyennes,
immédiatement suivi par le pneumocoque). Par voie hématogène, il peut atteindre
les méninges et provoquer une méningite (enfant de moins de 3 ans).
Occasionnellement il peut être responsable de laryngite et de laryngo-trachéite et
d'épiglottite.
• Chez les sujets à moyens de défense diminués :
Il peut être responsable de bronchites (chez les bronchitiques chroniques), de
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pneumonies, d'arthrites (plus rarement d'endocardites).
Haemophilus influenzae:

D. Etude bactériologique:
Microscope:
Dans les produits pathologiques, H.influenzae se présente sous la forme de tout
petits bacilles à Gram négatif, d'aspect coccobacillaire, groupés en amas, en
courtes chaînettes.
Les souches virulentes sont capsulées (comme pour le pneumocoque).

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Haemophilus influenzae:

Culture:
H.influenzae exige pour sa croissance les facteurs X et V qui sont présents dans la
gélose au sang cuit (gélose chocolat) ou dans la gélose ordinaire additionnée
d'extrait globulaire. le facteur X ou hémine et le facteur V ou NAD.
Les colonies apparaissent en 24-48 heures.

Exemples de culture sur une gélose au sang frais et une


gélose chocolat après 24 h d'incubation à 37°C.
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Haemophilus influenzae:

Culture:
Certaines souches possèdent une capsule polysaccharidique permettant de définir
différents sérotypes, de a à f (décrits par Miss M. Pittmann en 1931). Le type b est
le plus fréquent dont le polysaccharide capsulaire est le polyribosylribitol
phosphate (PRP).

Aspect de satellitisme observé


montrant
la double exigence en facteur X +
V d' Haemophilus influenzae.

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Haemophilus influenzae:
Caractères biochimiques:
Fact X Fact Synthèse Exigence Oxydase Catalase hémolyse
V porphyrines CO2
H. + + - - + + -
influenzae

Acidificatio D GLU D FRU Saccharose Lactose D-Xylose D-Ribose D-


n mannose
H. + - - - + + -
influenzae

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Haemophilus influenzae:

Diagnostic bactériologique:

• Le diagnostic est uniquement direct. Les prélèvements consistent en sécrétions


bronchiques prélevées par brossage bronchique protégé, pus, sang, liquide
céphalo-rachidien.
• L'examen microscopique est souvent très évocateur. Les bacilles peuvent être
identifiés directement sur le frottis par immunofluorescence. En cas de méningite,
la contre-immuno-électrophorèse ou l'agglutination de particules de Latex portant
des anticorps anticapsulaires de type b permet d'identifier la présence d'antigène
dans le liquide céphalo-rachidien.
• La culture se fait sur gélose chocolat et l'identification ultérieure des colonies, par
l'exigence en facteurs X et V, et par la mise en évidence de l'antigène capsulaire.
Elle sera toujours complétée par une recherche de la sensibilité aux antibiotiques,
notamment à l'ampicilline (existence ou non d'une betalactamase) et au
chloramphénicol.

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Haemophilus influenzae:

Sensibilité aux antibiotiques

- H. influenzae est une espèce naturellement sensible à de nombreux antibiotiques:

* ß-lactamines telles pénicillines (amoxicilline, AMX), céphalosporines de 3 ème


génération (céfotaxime, CTX)
* Phénicolés dont le chloramphénicol (C)
* Tétracyclines (T)
* Sulfamide seul (SSS) ou associé (SXT) au triméthoprime (TMP)
* Fluoroquinolones telle la ciprofloxacine (CIP)

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Haemophilus influenzae:

Antibiogramme d'une souche par diffusion


(méthode des disques)
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Haemophilus influenzae:

• La résistance naturelle concerne les macrolides comportant un cycle de 16 atomes,


les lincosamines, la bacitracine, le mécillinam, l'oxacilline et les glycopeptides.

• C'est une espèce modérément sensible aux macrolides (cycle 14 et 15 atomes)


(érythromycine ou ERY), les streptogramines, les céphalosporines de première
génération (céfalotine ou CF).

Comme d'autres espèces bactériennes, H. influenzae est concerné par la résistance


acquise touchant plusieurs familles d'antibiotiques.

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Haemophilus influenzae:

• ß-lactamines:
- le mécanisme le plus fréquent est la production de bêta-lactamase (bla de type
TEM).
L'activité des aminopénicillines est restaurée en présence d'un inhibiteur de ß-
lactamase.
-Un mécanisme non enzymatique est aussi observé reposant sur une modification
de la cible des bêta-lactamines, les PLP ou protéines de liaison à la pénicilline,
ayant subi des mutations ponctuelles entraînant des substitutions d'acides aminés
et une diminution de l'affinité pour les bêta-lactamines.

* La résistance acquise concerne la famille des tétracyclines (TET), des phénicolés


(C), des fluoroquinolones ou encore le triméthoprime-sulfaméthoxazole (SXT), mais
pour certains, l'incidence est très faible.

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Haemophilus influenzae:

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Haemophilus influenzae:

Autres haemophilus:
• H.ducreyi est l'agent du chancre mou, une maladie sexuellement transmise, qui
après une incubation d'une semaine en moyenne se traduit par une ulcération
génitale, profonde, inflammatoire et douloureuse et des adénopathies satellites
également douloureuses le plus souvent unilatérales (classique bubon).
Pour sa culture in vitro, le bacille exige le facteur X seulement.
Le chancre mou qui avait presque disparu de France est réapparu en 1973. A Paris,
depuis cette date, près de 2000 cas ont été signalés : traitement par l'association
sulfaméthoxazole-triméthoprime (Bactrim) pendant 3 semaines.
• H.aegyptus ou bacille de KOCH-WEEKS est l'agent de conjonctivite épidémique dans
les régions tropicales. Il exige les facteurs X et V.
• H.parainfluenzae est un commensal du rhinopharynx. Il peut être responsable
d'endocardite infectieuse. Il exige le facteur V seulement.
• H.haemolyticus et parahaemolyticus sont des commensaux du rhinopharynx. Ils
peuvent être associés à des infections de l'arbre respiratoire supérieur.
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Comme leur nom l'indique, ils sont hémolytiques sur gélose au sang.
Merci de votre attention.

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