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Identification et pathogénicité

des levures
Par
SALAMI Aïchat Yabo
DES 1 Biologie Clinique
2019-2020
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OBJECTIFS

• Définir levure

• Décrire les différentes étapes d’identification d’une levure au laboratoire

• Expliquer la pathogénicité des levures

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PLAN

Introduction

I-Généralités

I-1-Définitions

I-2-Intétet

I- 3-Rappels

II- Identification des levures

III- Pathogénie des levures

Conclusion 3
INTRODUCTION

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INTRODUCTION

• Diagnostic mycologique d’une levurose s’inscrit dans le cadre de la démarche


habituelle du diagnostic en microbiologie.

• Il comporte 4 étapes: prélèvement , examen direct et culture du produit


pathologique qui permettra d’isoler , éventuellement de dénombrer , puis d’identifier
(genre ,espèce) les levures.

• A coté de l’identification mycologique, la BM : outil complémentaire, particulièrement


remarquable dans la surveillance épidémiologique (génotypage).
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GENERALITES

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I-GENERALITES
I-1-Définitions

• Levures : thalle constitué d’éléments unicellulaires, ronds, ou ovalaires, mesurant de 3


à 14µm de long sur 2 à 5 µm de large qui peut être associé à du pseudomycélium ou à
du mycélium vrai.

• Colonies seront donc crémeuses, muqueuses, ou finement duveteuses;

• Croissance est rapide: 24 à 48H à 30-37°C.

• Colonies sont le plus souvent blanches, parfois jaunes ou roses

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I-GENERALITES
I-1-Définitions

• Levures se reproduisent de façon asexuée par bourgeonnement (blastospore)

Ou par fragmentation du thalle (arthrospores).

• Ce sont des saprophytes ou des commensaux qui peuvent déterminer des atteintes
superficielles ou envahir les profonds.

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I-GENERALITES
I-1-Définitions

 En 2012 , on compte 597 espèces de levures.

 Seulement 7 ont un intérêt médical.

Genre Candida
Genre Cryptococcus
Genre Rhodotorula
Genre Trichosporon
Genre Geotrichum
Genre Malassezia
Genre Saccharomyces
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I-GENERALITES
I-2-Intéret

• Epidémiologique: Fréquence (l’émergence du sida a entraîné une efflorescence de


candidoses oropharyngées)

• Clinique : Grave responsable des septicémies (genre Candida)

• Diagnostic: simple

• Thérapeutique : sont sensibles en générale aux anti-mycosiques usuels

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I-GENERALITES
I-3-Rappels

• Prélèvement

- Diagnostic de levurose repose sur un prélèvement de qualité

- Prélèvement est réalisé idéalement avant tout traitement antifongique

Il sera recueilli dans un récipient stérile, devra être acheminé rapidement au laboratoire
Localisation et nature différente :
Pulmonaire: Rincer la bouche par 1 antiseptique
Cutanée: Recueillir des squames pour éliminer la flore commensale
Scotch test cutané Hémoculture
Muqueuse: Recueillir des sérosités Cérébrale: LCR
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I-GENERALITES
I-3-Rappels

Examen direct

• Essentiel: 1ère étape de diagnostic au laboratoire

• Modalités techniques de l’ED varient selon la nature et la consistance du produit


pathologique et selon le type de levure recherché

• Permet de rechercher des levures bourgeonnantes ou des filaments mycéliens

• ED négatif ne permet pas d’exclure un diagnostic de levurose ,toute fois en cas de


négativité , l’interprétation des cultures est beaucoup plus délicate
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I-GENERALITES
I-3-Rappels

Examen direct
- KOH
- Eau physiologique
- Encre de chine
- Coloration (Gomori-Grocott : pas en
routine,complexe,coloration au
MGG,coloration de Gram
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I-GENERALITES
I-3-Rappels

• Ensemencement

- A l’exception des Malassezia


lipodépendants, les levures
rencontrées chez l’homme peuvent
pousser sur les milieux de culture
utilisés en bactériologie;

- Toute fois le milieu de Sabouraud


est le plus adapté 14
IDENTIFICATION DES LEVURES

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II-IDENTIFICATION DES LEVURES

• Repose surtout sur l’étude de caractères biochimiques, mais la morphologie macroscopique et

microscopique des cultures s’avère souvent utile.

•Aspect des colonies et couleur , on recherchera à l’examen microscopique la forme des

blastospores leur taille et le mode de bourgeonnement, ainsi que la présence ou non

d’arthrospores mais surtout sur des tests physiologiques ( test de blastèse, recherche de la

chlamydosporulation), immunologiques (Bichro-latex albicans) ou biochimiques

(auxanogramme du carborne ou zymograme)


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II-IDENTIFICATION

• Spectrométrie de masse MALDI-TOF ,

apport indéniable à ID des levures

• En dernier recours , l’ID d’une levure

peut être réalisée par des techniques de

biologie moléculaire

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Prélèvement

Examen direct
Candida

•Eléments bourgeonnants de 1 à 10 µm,


ovales ou ronds, à paroi mince, non capsulés

•Présence ou non de filaments mycéliens de


longueur variable.

• La numération des levures dans les urines


est recommandée.

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Cryptococcus Prélèvement

Examen direct

Cryptococcus

• Levures capsulées dans le culot de centrifugation


des liquides biologiques, dans le pus et les
biopsies.

• Test à l’encre de chine sur les liquides


biologiques: met en évidence la capsule.

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Prélèvement
Malassezia Examen direct

Malassezia

•Amas de blastospores rondes à ovales (3 à 5 µm)


avec un double contour net donnant un aspect en
« grappe de raisin »

• Des filaments trapus et courts.

•Certaines levures présentent un bourgeon unipolaire


donnant un aspect en « bouteille ».

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Prélèvement
Ensemencement
Examen direct

Milieux Sabouraud-chloramphénicol
chromogéniques Sabouraud -Chl-Actidione

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Ensemencement Prélèvement

Sabouraud-chloramphénicol
Sabouraud-chl- Actidione
Examen direct

Incubation 28°-37°
48h 3 semaines

Candida
Colonie blanchâtre Colonies blanches à crème,
luisantes ou mates, lisses ou
Test de filamentation: plissées
•Sérum de lapin+ qlq colonies
•Incubation à 37°C entre 2 heures 30 et 4 heures maximum.
•Observation à l’objectif 40.
•Filamentation en « doigts de gant »: tube germinatif
Test de filamentation
C. albicans
Bichro-latex albicans
Candida albicans/ Test de chlamydosporulation
Bichro-dubli
Candida dubliniensis
C.dubliniensis
•Pas de filamentation → levure du genre Candida non albicans. 22
Ensemencement Prélèvement

Sabouraud-chloramphénicol
Examen direct
Sabouraud-chl- Actidione
Milieux
chromogéniques Incubation
Candida

Colonie
blanchâtre

Colonie rose Rhodotorula

Couleur très caractéristique

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Prélèvement
Ensemencement

Sabouraud-chloramphénicol Examen direct

Sabouraud -chl-Actidione

Milieux Incubation
chromogéniques Trichosporon
Colonie
cérébriforme, lisse

Microscope

Blastopores, Arthrospores

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Ensemencement Prélèvement

Sabouraud-chloramphénicol
Sabouraud-chl-Actidione Examen direct
Milieux
chromogéniques Incubation

Colonie Geotrichum
cérébriforme

Microscope

Uniquement des Arthrospores

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Ensemencement Prélèvement

Milieux Sabouraud-chloramphénicol Examen direct


chromogéniques
Sabouraud-chl-Actidione

Incubation

Colonie Trichosporon : Arthrospores et Blastospores


cérébriforme
Urée + Trichosporon

Geotrichum : Uniquement Arthrospores


Colonie Urée - Geotrichum
cérébriforme

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Ensemencement Prélèvement

Milieux Sabouraud-chloramphénicol Présence de


chromogéniques Examen direct
Sabouraud-chl-Actidione capsule

Incubation

Colonie
muqueuse,
Cryptococcus
coulant, couleur
beige

• Présence d’une capsule (si elle est réduite, repiquer sur milieu
maltosé).
• Pousse à 37°C sans actidione. Cryptococcus
• Uréase + en 4 heures à 37°C. neoformans
• Assimilation des sucres: les Cryptocoques assimilent certains sucres
dont le galactose, tréhalose, Inositol (test Fungiscreen®).
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Ensemencement Prélèvement

Milieux Sabouraud-chloramphénicol Présence Examen direct


chromogéniques Sabouraud–chl-Actidione de capsule

Incubation

Colonie muqueuse, Cryptococcus


coulant, couleur
beige

Cryptococcus
neoformans

Différenciation entre les variétés: Utilisation du milieu Canavanine –


Glycine – Bleu de Bromothymol (verdâtre au début).
Pas de virage: Var neoformans Différenciation entre
sérotypes(valeur
épidémiologique)
Virage au bleu: Var gatii
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Ensemencement Prélèvement

Sabouraud/chl+ recouvert Examen direct


d’huile d’olive
Milieu de Dixon Grappe de raisin

Incubation 8-15jours

Tapis blanchâtre caractéristique:


petites colonies rondes, beiges,
dégageant une odeur fruitée
caractéristique
Malassezia

La culrure n’est pas


Microscopie: Levures rondes ou ovales à indispensable
bourgeonnement unipolaire. au diagnostic
Uréase positive
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Ensemencement Prélèvement

Milieux Sabouraud-chloramphénicol Examen direct


chromogéniques Sabouraud Actidione

 Utilisés pour les prélèvements polymicrobiens

 ID directe sur le primo-isolement: rapide et économique


 l’isolement sélectif des levures et l’identification directe de
C.albicans. Ils permettent aussi l’identification présomptive de
Candida tropicalis, Candida glabrata et de Candida krusei.
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Ensemencement Prélèvement

Milieux Sabouraud-chloramphénicol
chromogéniques Sabouraud-chl-Actidione Examen direct

Incubation Colonie blanchâtre

Chlamydosporulation: et/ou
Test filamentation et/ou Bicholatex -
Candida spp pseudomycélium
-

Candida spp

Réaliser une galerie

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Identification des autres espèces de Candida:

 Galeries permettant de déterminer les caractères physiologiques de la


souche: assimilation (auxanogramme) et fermentation (zymogramme) des
sucres.

• ID 32C® (63 taxons): 29 tests d’assimilation (sucres, acides organiques et


acides aminés).
• API 20C AUX® (44 taxons): 19 tests d’assimilation
• Auxacolor® (26 taxons et 13 sucres): assimilation de sucres et résistance à
l’actidione.
• Fungichrom® (23 taxons): mise en évidence des activités enzymatiques par
hydrolyse de substrats chromogéniques, par assimilation de substrats
naturels et par oxydation de substrats synthétiques.
• Vitek 2: système automatisé , analyse 64 taxon 32
II-IDENTIFICATION DES LEVURES

Spectrométrie de masse de type MALDI-TOF

Séparation des molécules transformées en ions en fonction de leur


rapport masse/charge. Présente deux avantages majeurs :

- sa rapidité d’exécution permet un gain de 24H-48H

- identification précise au niveau de l’espèce , y compris au niveau du


genres pour lesquels la discrimination est difficile sur une base
morphologique ou entre espèce appartenant au même complexe
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II-IDENTIFICATION DES LEVURES

Biologie moléculaire:

• Lorsque les méthodes précédentes n’ont pas permis l’identification du champignon


d’intérêt, une identification par la biologie moléculaire est possible.

• Séquençage des différentes cibles moléculaire : les régions ITS, 18S, ou 28S de l’ADN,
le gène de la calmoduline, de la B-tubuline, ou du facteur d’élongation,

ID au niveau du genre et de l’espèce, y compris au sein de complexes d’espèces

• Exemples: C.dubliniensis # C.albicans


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II-IDENTIFICATION DES LEVURES
Interprétation

 Levures isolées d’un produit biologique normalement stérile (liquide, tissu):

Présente une haute valeur diagnostique, si une seule espèce est retrouvée en culture,

en grand nombre , et sans autres germes associés

 Levures isolées d’un conduit naturel ou de la peau et des phanères:

Devant l’isolement de levures à partir de ces prélèvements habituellement non stériles,

il faudra tenir compte: des résultats de l’ED ; de l’abondance de levures en culture; d’une
colonisation préalable 35
RECAPITULATIF

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Ensemencement Prélèvement Mycélium

Amats blastospores

Milieux Sabouraud-chloramphénicol Capsule


Examen direct
chromogéniques Sabouraud -Chl-Actidione
Candida Galerie
spp

Colonie vert-rose Colonie blanchâtre Candida Test filamentation


Chlamydosporulation Candidia albicans
Bichrolatex

Candida albicans Colonie rose Rhodotorula


Arthrospores et
Colonie en vert Colonie cérébriforme Blastospores Urée+ Trichosporon

Autres techniques Colonie cérébriforme Uniquement


Blastospores Urée Géotrichum
-
C.krusei C.glabrata
Colonie muqueuse, Capsule
coulant, couleur beige Pousse à 37° sans Cryptococcus
Candida spp Actidione Urée + neoformans
colonies rondes,
beiges, dégageant rondes ou ovales à
une odeur fruitée bourgenm Malassezia
Galeri unipolaire. 37
e caractéristique Uréase +
PATHOGENICITE DES LEVURES

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III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

Candida

Candida albicans : espèce de levure impliquée en pathologie humaine (6O%)

candidoses superficielles = non invasives (très fréquentes, prolifération d’espèces


commensales présence de FDR)

- Digestive: oropharyngée, et intestinale (FDR:VIH, port des prothèses dentaires)


- Cutanée = intertrigo: grand plis +++ , petit+ (FDR: macération, obésité, diabète)
- Génitale : femme ( FDR: contraception orale, vulvovaginite) homme( FDR: balanite)
- Unguéale: mains +++ pieds+ (FDR: exposition à l’humidité et aux détergent)
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III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

Candida
candidoses profondes = invasives
FDR:
Mode de contamination: - immunodépression,
- altération des barrières (chirurgie
- endogène par une espèce colonisant l’individu
digestif)
- exogène lié à l’implantation de matériels étrangers
- modification de la flore,
(cathéters ,sondes..) (antibiothérapie)
- Facteurs physiologiques: (âges
extrêmes , grossesse) 40
III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

Cryptococcus

 Espèce pathogène : Cryptococcus neoformans.

 Agent de la cryptococcose/ mycose cosmopolite d’origine exogène, d’évolution aigue,


subaigüe ou chronique

• FDR lymphopénie LTCD4+ VIH (majorité des cas),hémopathies malignes,

• immunodéprimé: Pneumopathie, méningo-encéphalite, autres localisations


(atteintes cutanée, rarement atteinte osseuse, oculaire, cardiaque)
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III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

• Malassezia

Levures commensales de la peau, lipophiles et kératinophiles.

Aspect clinique: -Atteintes superficielles (fréquentes récidiventes ): Pityriasis


versicolor ( fréquente, macules arrondies peu prurigineuses et finement squameuses)

Pityriasis captis (état pelliculaire du cuir chevelu), folliculite , dermite séborrhéique

- Atteintes profondes (exeptionnelles): patients immununodéprimés


ou prématurés nourris par alimentation penratérale , hyperlipidique
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III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

Trichosporon

 Retrouvé souvent à l’état commensal sur le revêtement cutané/ Infections


superficielles ou profondes chez l’immunodéprimé.

Rhodotorula

• Levures rouges, commensal de la peau et du tube digestif ; exceptionnellement


responsable d’infections superficielles (kératites) ou profondes

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III- PATHOGÉNIE DES LEVURES

Geotrichum
Fréquement isolé dans les prélèvements digestifs
Exceptionnellement pathogène en cas d’immunosupression
Saccharomyces
Rôle pathogène exeptionnelle ( patient ID mais aussi cancers, hémopathies.)
Isolé dans les prélèvements digestifs
 Diagnostic difficile en raison du caractère commensal de ces levures

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CONCLUSION

45
CONCLUSION

• Levures: type de champignons unicellulaires

• 7 genres présentant un intérêt médical

• Genres Candida et Cryptococcus pathogène avec possibilité de mise en jeu du


pronostic vital

• Identification allant du prélèvement à la culture (microscopie et macroscopie)

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