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TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC

DES PARASITOSES
OPPORTUNISTES

SALAMI Aichat yabo


DES 1 Biologie clinique
Année Académique: 2019-2020 1
OBJECTIFS

• Définir la parasite opportuniste

• Citer les différentes parasites opportunistes

• Décrire les étapes du diagnostic parasitologique de la sarcocystose,


l’isosporose, la cryptosporidiose, cyclosporose et de la microsporidiose

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PLAN

Introduction

1-Généralités
-Définitions
- Intéret

2- Parasite opportunistes
- Rappel
- Diagnostics

Conclusion 3
INTRODUCTION

• L’immunodépression favorise la survenue de plusieurs affections opportunistes


responsables d’une importante mortalité.

• Parasitoses intestinales sont les principaux agents responsables de diarrhée chronique


sévère. Les parasitoses « dites opportunistes » les plus fréquemment incriminées dans la
genèse de cette diarrhée sont les coccidioses (cryptosporidiose, isosporose,
cyclosporose,sarcocystose ) et les microsporidioses

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INTRODUCTION

• Microsporidies, maintenant classées dans le règne fongique, et dont certaines


sont responsables de troubles intestinaux, sont également traitées dans ce
chapitre. Leur identification nécessite la mise en œuvre de techniques
spécifiques qui ne sont pas pratiquées en routine dans tous les laboratoires

• Chez les personnes immunocompétents, ces infections peuvent être également


mais leurs manifestations cliniques sont moins sévères et généralement
spontanément résolutives.

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1-Généralités
1-1-Définition

• Parasites opportunistes = infection due a des protozoaires survenant chez les patients

présentant un déficit immunitaire et traduisant une susceptibilité particulaire de l ’hote.

• Il s’agit des coccidies et microsporidies

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1-Généralités
1-1-Définition

5 protozooses intestinales répondent à la définition de parasitoses opportunistes:

Cryptosporidiose

Isosporose Coccidies
Sarcocystose

Cyclosporose

Microsporidioses

• Cyclosporose ne sera pas étudiée car moins fréquente 7


1-Généralités
1-2-Intéret

• Affections cosmopolites et fréquentes surtout en contexte tropical

• Impliquées dans les épidémies d’origine alimentaire et/ou hydrique

• Certaines d’entre elles ont un caractère opportuniste chez les immunodéprimés

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

• Coccidioses intestinales : Ensemble de parasitoses dues à des coccidies:


sporozoaires intracellulaires (Apicomplexa) dépourvus d’appareil locomoteur, et
qui se multiplient principalement au niveau de l’intestin mais peuvent diffuser
dans d’autres tissus.

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose
Taxonomie
• Classe: Sporozoea
• Sous classe: Coccidia
• Ordre: Eucoccidida
• Famille: Cryptosporididae
• Genre: Cryptosporidium
• Espèce: C. hominis, C.parvum, C.felis, C.bovis, C.muris
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses
2-1-1-Cryptosporidiose

• Cryptosporidiose est une protozoose digestive, transmise par consommation d'eau ou au


contact d'individus ou d'animaux infectés.

• Développement du parasite a lieu dans la bordure en brosse des entérocytes et provoque


une diarrhée.

• Spontanément résolutive chez les patients immunocompétents, la cryptosporidiose peut


une diarrhée chronique et résistante aux traitements chez les immunodéprimés, ou un
retard de croissance et une malnutrition chez les nourrissons. 11
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose
Morphologie

Figure n°6: Oocyste mûr de Cryptosporidium sp


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique

Nature du prélèvement: Selles fraîchement émises

Techniques:
• Etat frais
• Techniques de concentration
• Coloration
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique / Techniques

• Etat frais:
Prélever une petite portion de matières fécales
Etaler sur une lame en diluant au besoin dans un peu d’eau physiologique
Recouvrir d’une lamelle et observer au microscope optique aux
grossissements X10 et X40
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques

• Avantages: il s’agit d’une technique simple, qui peut permettre déjà à ce stade de
mettre en évidence le parasite

• Limite: peu sensible surtout lorsque le parasite est présent en faible quantité. Les
oocystes peuvent en effet être confondus avec d'autres micro-organismes (levures,
Blastocystis hominis, kystes de flagellés)
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

• Méthode de Ziehl -Neelsen à froid : obligatoire pour les cryptosporidies.

Réactif : Fuschine de Ziehl, méthanol, solution d'acide sulfurique dilué, vert


malachite à 5%

Technique :

- étalement des matières fécales sur une lame

- fixation au méthanol 2 à 5 mn 16
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

• Méthode de Ziehl -Neelsen à froid : obligatoire pour les cryptosporidies.

séchage - coloration à la fuschine (filtrée) : une heure

- rinçage à l'eau

- différenciation par une solution d'acide sulfurique à 2 % : 15 à 20 secondes

- rinçage à l'eau
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

• Méthode de Ziehl -Neelsen à froid : obligatoire pour les cryptosporidies.

- séchage à l'air

- montage sous lamelle à l'huile à immersion - lecture à l'objectif 25

Résultat : les oocystes de cryptosporidies sont colorés en rose indien sur fond vert
ou bleu.
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

Résultat

Etat frais

Figure n°1: Oocyste de cryptosporidie


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

Résultat

Coloration Zhiel

Figure n°2: Oocyste de cryptosporidie


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration
• La coloration de Heine : est une méthode simple et peu coûteuse, mais ne
permet pas un examen différé de la préparation. Les oocystes incolores, très
réfringents, se détachent du fond rouge du colorant . À fort grossissement leur
organisation interne est visible .

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-1- Diagnostic parasitologique/ Techniques de concentration

• La coloration de Heine

Figures 3: Oocystes de Cryptosporidium


parvum Au fort grossissement, on observe
la structure interne irrégulière (noyaux des
sporozoïtes) des oocystes
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-2- Méthodes immunologiques

• Immunoflorescence directe: utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre


des déterminants antigéniques de la paroi des oocystes

• ELISA: recherche de coproantigènes de cryptosporidies grâce à un mélange


d’anticorps monoclonaux et polyclonaux

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-3- Biologie moléculaire

• PCR: L’amplification d’une région du gène codant la petite sous-unité de l’ARN


ribosomal (ARNr 18S) pour différencier les espèces de Cryptosporidium

• Réservé aux laboratoires spécialisés

• Pas utilisé en routine car cher et laborieux

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-3- Diagnostic anatomo-pathologique

• L’examen histopathologique de biopsies duodénales va mettre en évidence une


atrophie villositaire, allongement des cryptes.

• Les cryptosporidies apparaissent comme des organismes arrondis de 3 à 6 μm de


diamètre accolés à la surface de la muqueuse

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-1-Cryptosporidiose/Diagnostic biologique
2-1-1-3- Diagnostic anatomo-pathologique:

Figure n°4: Biopsie intestinale montrant des


cryptosporidies à la surface de la muqueuse
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose
Taxonomie

• Règne: Protista

• Sous règne: Protozoa

• Phylum: Apicomplexa

• Classe: Sporozoea

• Sous classe: Coccidia


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose

• Coccidiose intestinale due à Isospora belli qui parasite les cellules intestinales de
l'homme.

• Elle est liée au péril fécal et fréquente dans les régions tropicales et subtropicales
surtout chez les personnes immunodéprimées.

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose
Taxonomie

• Ordre: Eucoccidida

• Famille: Eimeriidae

• Genre: Isospora, Cytoisospora

• Espèce: Cytoisosopora belli (Homme) et Isospora sui (Porc)

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Nature du prélèvement:
• Selles fraîchement émises ou liquide de tubage duodénal

Techniques:
• Etat frais (Identique que les autres)
• Techniques de concentration
• Coloration
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Techniques:

Techniques de concentration

• Technique de concentration par une méthode de Ritchie


Principe: Concentration obtenue en combinant la sédimentation par
centrifugation et l'élimination des résidus de la digestion par l'action
dissolvante de l'éther éthylique
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Techniques:

Techniques de concentration

• Technique de concentration par une méthode de Ritchie


Mode opératoire
oDiluer un volume de selles dans une solution de formol à 10%.
oMélanger et laisser sédimenter
oTamiser à l'aide d'une passoire avec des pores fins
oAjouter l'éther au 1/3.
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
Techniques de concentration

• Technique de concentration par une méthode de Ritchie

Mode opératoire

Mode opératoire
o Agiter vigoureusement jusqu'à l'obtention d'une solution homogène

o Centrifuger à 1500 tours/min pendant 2 minutes.

o Rejeter le surnageant.

o Examiner le culot entre lame et lamelle 33


2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Techniques:

Techniques de concentration

• Coloration du culot au Zhiel (Identique à celui de criposporidiose)

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Résultat

Etat frais

Figure n°5: Oocyste non sporulé de Isospora Figure n°6: Oocyste mature de Isospora
35belli
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Résultat

- Coloration au Zhiel

Figure n°7: Oocyste de Isospora belli coloré au Zhiel


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
- Interprétations

• la présence d’oocystes d’Isospora belli à l’examen des selles ou dans le


liquide duodénal confirmera le diagnostic d’isosporose

• En cas de recherche négative, examens doivent être repris sur 3 échantillons


à 2 ou 3 jours d’intervalle à cause de l’élimination discontinue des oocystes

Figure n°4: Oocyste de Isospora belli coloré au Zhiel


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1-2-Isosporose/Diagnostic biologique
 Diagnostic histologique

• L’examen histopathologique de biopsies intestinales après coloration à


l’hématoxyline permet de voir les parasites en cours de multiplication dans les
entérocytes.

• on note une atrophie des villosités, hyperplasie des cryptes. Parfois de nombreuses
cellules éosinophiles dans le chorion

Figure n°4: Oocyste de Isospora belli coloré au Zhiel


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose

Taxonomie

• Phylum : Apicomplexa

• Classe : Sporozoae

• Sous-classe : Coccidia

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose
• Comme I. belli, Sarcocystis hominis est un protozoaire appartenant à la sous-classe des
coccidies. C'est un parasite dixène, l'hôte définitif étant l'homme et les hôtes
intermédiaires, le bœuf pour Sarcocystis bovis hominis et le porc pour Sarcocystis suis
hominis.

Figure n°8: Oocyste non sporulé


de Sarcocystis hominis 40
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose
• L'homme se contamine en consommant de la viande de porc ou de bœuf
contenant des kystes intramusculaires.

• Ceux-ci éclatent et libèrent dans la lumière intestinale des bradyzoïtes qui


parasitent les entérocytes et permettent l'amorce du cycle sexué.

• A l'issue de celui-ci, des oocystes sont éliminés dans les selles, mais le plus
souvent ils libèrent des sporocystes qui seront retrouvés dans les selles.
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique

 Forme digestive

Elément d’orientation

• Une sarcocystose peut être découverte :

• de façon fortuite lors d’un EPS

• lors de diarrhées hydriques chez un sujet ayant des habitudes alimentaires telles que la
consommation de viandes saignantes (peu cuites)

• en investiguant des diarrhées hydriques spontanément résolutives en quelques jours 42


2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique

 Forme digestive

Nature du prélèvement: Il s’agit de selles fraîchement émises, parfois de liquide de tubage


duodénal

Techniques :
• Examen macroscopique
• Examen microscopique direct ou état frais
• Examen microscopique après concentration
• Technique de Kato (+++) 43
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique

 Forme digestive

Techniques :

• Technique de Kato Katz

Faire tremper pendant 24h une bande de cellophane dans la préparation


d’eau glycérinée et de vert malachite

Réaliser un frottis épais de selles sur une lame porte objet 44


2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique
 Forme digestive

Techniques :

• Technique de Kato Katz

Recouvrir par une bande de cellophane

Ecraser sous papier buvard pour bien étaler le frottis

Laisser 1h à température ambiante

Observer au grossissement X40 45


2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique
 Forme digestive

Techniques :

• Résultats et interprétations

La recherche est déclarée positive si les

sporocystes du parasite sont retrouvés dans les selles

Figure n°9 Sporocystes de S.46


hominis 
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique
 Forme digestive

Examen anatomo-pathologique :

• Se fait uniquement dans les formes graves (entérites nécrosantes), sur une
biopsie de la muqueuse intestinale colorée à l’hémalum-éosine ou au MGG
et peut permettre de mettre en évidence le parasite

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-1-coccidioses

2-1- 3-Sarcocytose/Diagnostic biologique
 Forme musculaire

• Il se fait par l’examen anatomo-pathologique d’une biopsie musculaire pour


la mise en évidence des kystes.

Figure n°10: Biopsie musculaire montrant un


kyste de sarcocyste 48
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

Famille ( existe 6 dont 2 pathogènes de l’homme)


- Encephalitozoonidea
- Enterocytozoonidea
Espèces (4 ayant un pouvoir pathogène chez l’homme)
- Encephalitozoon intestinalis → microsporidiose intestinale
- Enterocytozoon bieneusi → microsporidiose intestinale
- Encephalitozoon hellem → kérato-conjonctivite
- Encephalitozoon cuniculi → microsporidiose cérébrale
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• Microsporidies sont des parasites obligatoires intracellulaires qui infectent


un grand nombre de vertébrés et d'invertébrés.

• Parasites sont maintenant reconnus comme étant des pathogènes souvent


rencontrés chez les sujets infectés par le virus de l'immunodéficience
humaine (VIH).

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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

Diagnostic biologique
• Diagnostic des microsporidies est classiquement posé par l'examen direct en
microscopie optique des prélèvements de selles ou de biopsies intestinales,
mais l'identification d'espèce en microscopie optique est impossible.

• La détection de l'acide désoxyribonucléique (ADN) des microsporidies par


polymerase chain reaction (PCR), dans les différents échantillons biologiques
incluant les biopsies gastro-intestinales, est maintenant développée. 51
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• DIAGNOSTIC DIRECT

1) Examen parasitologique des selles :

Il est impératif d'effectuer plusieurs fois la recherche, au moins sur 3 selles


différentes. La faible taille des spores ne permet pas leur détection sans
marquage particulier. A l'heure actuelle, deux techniques sont utilisées

52
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

Diagnostic directe

▪ Prélèvements: selles fraîchement émises, liquide duodénal,

53
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• DIAGNOSTIC DIRECT

▪ Examen microscopique

• Deux techniques colorimétriques:

- Coloration au trichome de Weber: méthode de référence,


performante, spécifique

- Coloration à l’Uvitex 2B de Van Gool (agent chimiofluorescent se


fixant sur la chitine de l’endospore): sensible 54
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• DIAGNOSTIC DIRECT

▪ Examen microscopique

• Microscope électronique: diagnostic de confirmation par excellence

-Basé sur l’identification de l’ultrastructure de microsporidies (filament


polaire).

-Différence entre E. intestinalis et E. bieneusi est la taille de E. bieneusi


plus petite.
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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• DIAGNOSTIC DIRECT
▪ Examen microscopique

Spores rose-rouge de Enterocytozoon bieneusi colorées par la


technique de Weber

Figure n°11: Spores rose-rouge de


Enterocytozoon bieneusi 56
2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

• DIAGNOSTIC DIRECT
▪ Examen microscopique

Spores de Enterocytozoon bieneusi colorées par l’Uvitex 2B

Figure n°12: Spores de Enterocytozoon bieneusi


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2-PARASITES OPPORTUNISTES
2-2-Microsporidium

Biopsie duodénale

- Permet de mettre en évidence la microsporidiose intestinale

58
CONCLUSION

5 protozooses intestinales répondent à la définition de parasitoses opportunistes:

infections dont la gravité ou la fréquence est élevée chez les patients ayant un déficit

immunitaire : -cryptosporidiose

- isosporose,

- cyclosporose,sarcocystose )

- microsporidioses
59
CONCLUSION

• Chez les sujets immunocompétents il s’agit souvent de maladies bénignes

• Il est basé sur la mise en évidence des oocystes dans les selles lors d’un examen
parasitologique à frais ou après coloration.

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