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V- Les Mutations induites: La mutagénèse

On peut à présent créer in vitro et in vivo des


mutations spécifiques dans n'importe quelle
partie d'un gène et évaluer les effets de ces
changements.
Il y a deux grands types de mutagenèse : la
mutagenèse aléatoire et la mutagenèse dirigée.
Les méthodes de mutagenèse aléatoire génèrent
des mutations n'importe où dans un gène tandis
que la méthode de mutagenèse dirigée crée des
mutations exactement où l'on veut.
• Les agents désaminants: l’acide nitreux (HNO2)est à l’origine de déaminations (ex :
C ->U ; meC->T (dans point chaud CpG) ; A-> hypoxanthine; G-> xanthine).

• Les agents alkylants : la nitrosoguanidine NG, l’éthyl-méthylsulfonate EMS, l’ethyl-


éthylsulfonate EES réagissent avec les bases en ajoutant des groupements méthyl ou
éthyl. – Alkylation.Les atomes les plus réactifs sont le N7 de la guanine, le N3 de
l'adénine ou le O6 de la guanine. Cette alkylation n'est souvent pas reconnue par les
systèmes de réparation et entraîne une différence d'appariement.

• Les agents intercalants : Acridine, BET sont des molécules qui s’insèrent entre les
bases de l’ADN. Ceci entraîne un étirement de l’ADN. La polymérase insère alors une
base surnuméraire en face de la molécule étrangère.
Les radiations : La fraction biologiquement active du spectre électromagnétique est
constituée par les UV, les rayons X et gamma.
• Les radiations ionisantes :

Les rayons X et gamma sont assez énergétiques pour produire des radicaux
libres (ions possédant électrons non appariés) chimiquement très réactifs notamment
avec l'ADN ou peuvent agir par action directe sur l'ADN.
On regroupe également sous ce terme les radiations corpusculaires, flux de
particules atomiques et subatomiques émises par les éléments radioactifs. Elles sont
de deux types : les particules alpha (noyau de l'hélium 2H+ + 2 neutrons) et les
particules bêta (des électrons).
Les rayons X et gamma entraînent :
- des altérations ou pertes de bases;
- des ruptures dans l'un ou les deux brins qui peuvent conduire à des
réarrangements, délétions, perte de fragments de chromosome…
- l'enchevêtrement de l'ADN avec lui-même ou avec des protéines.

Il y a une relation entre la dose de rayonnement et le taux de mutations car l'effet des
radiations est cumulatif.
Mécanismes d’action des rayonnements ionisants par effet direct et indirect.
Effet direct : interaction de la molécule d’ADN et d’un électron mis en mouvement à la
suite de l’absorption d’un photon.
Effet indirect : un électron mis en mouvement à la suite de l’absorption d’un photon
interagit avec une molécule d’eau générant la production d’un radical tel que OH., qui à
son tour provoque une lésion au niveau de la molécule d’ADN.
La radiolyse de l’eau
• Les effets des UV :
Ils ne sont pas parmi les plus énergétiques et ne sont pas ionisants, mais leurs
longueurs d'onde sont absorbées préférentiellement par des bases de l'ADN et par les
acides aminés aromatiques des protéines.
On distingue parmi les UV :
· les UV-C (180 - 290 nm) : les plus énergétiques. Ils son létaux mais absorbés par la
couche d'ozone.
· les UV-B (290 - 320 nm) : ils peuvent être létaux. Ils constituent le rayonnement
mutagène de la lumière solaire.
· les UV-A (320 - visible) : ils ont des effets délétères parce qu'ils créent des radicaux
oxygénés mais ils produisent peu de dimères de pyrimidines.

La plupart des lésions létales sont des dimères entre bases pyrimidiques ( T-T ou T-C)
dans l'ADN, résultat de l'établissement d'une liaison covalente entre pyrimidines
adjacentes sur un brin. Ces dimères comme la majeure partie des lésions d'origine
chimique, bloquent la transcription et la réplication. Elles sont létales si elles ne sont pas
réparées. Elles génèrent aussi des mutations et des réarrangements chromosomiques.
Lésions radio-induites de l'ADN
Utilisation d'enzymes
PCR mutagénéisante

Lorsque aucune information structurale ou mécanistique sur la protéine à muter


n’est connue les banques sont générées par l’introduction de mutations
aléatoires le long du gène. La méthode de PCR mutagénéisante ou "error-
prone PCR" (ep-PCR) est basée sur la propriété de la Taq polymérase à
générer des erreurs au cours de cycles PCR. Alors que le taux basal de
mutations est d’environ 1 pour 1000 pb, ce taux d’erreur peut être
augmenté avec de plus grandes concentrations en MgCl2, en ajoutant du
MnCl2 et en jouant sur des concentrations non équivalentes des quatre
dNTPs. De cette manière, l’amplification du gène cible par PCR va générer
de la diversité à chaque tour par l’introduction d’erreurs, dont le taux est
généralement d’environ 7 pour 1000 pb. On peut faire varier ce taux d’erreurs
en jouant sur les concentrations en Mg2+, Mn2+ ou sur le nombre de cycles
PCR.
Méthodes de mutagenèse aléatoire ciblées sur une séquence déterminée du gène :
mutagénèse par cassette (« cassette mutagenesis »)
Oligonucleotide-directed mutagenesis.
Asterisks indicate mismatched bases.
Originally the Klenow fragment of DNA
polymerase was used, but now this has
been largely replaced with T7
polymerase.
Élimination du brin parental (1)
Élimination du brin parental (2)
A partir d’un ADN double brins

Mutations par PCR aux bornes d'un segment d'ADN

Les portions en rouge représentent les régions apportant une mutation.


Cette mutation se retrouve, in fine, dans le produit d'amplification.
PCR-mediated deletion mutagenesis

Target DNA

PCR products

Oligonucleotide design allows precision in deletion positions


A partir d’un ADN double brins

PCR de fusion
Technique du mega primer