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MÉTHODES ANALYTIQUES

POUR ÉTUDES
TOXICOLOGIQUES

Marlène Lacroix
26/01/2012
ANALYTIQUE DANS LES ETUDES
TOXICOLOGIQUES

Evaluation de la contamination :
Source
Matrices environnementales (sols, air,
d’exposition eaux, aliments…)

Absorption Etude du contaminant et des ses


Distribution métabolites dans l’organisme :
Métabolisme Matrices biologiques (sang, tissus, urines,
Elimination fèces…)

Etude de biomarqueurs :
Effets Endogènes (Hormones, Acides aminés,
biologiques Lipides…) ou exogènes
dans matrices biologiques
2
LES TECHNIQUES ANALYTIQUES PRINCIPALES

Immunochimique Chromatographique
(Elisa, RIA, (HPLC, GC, CE)
Chemiluminescence)

3
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE : PRINCIPE
Principe basé sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps

2 méthodes de dosage :
 Réactifs en excès (dosage sans compétition)
 Réactifs limitant (dosage avec compétition)

Classification des méthodes de dosage :


Dosage sans compétition
Traceur Dosage avec compétition

Immunoradiometric assay
Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA)
(IRMA)

Enzymoimmunoassay Enzyme-labeled
Enzyme
(EIA) immunosorbent assay (ELISA)

Immunofluorometric assay
Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA)
(IFMA)
Luminoimmunoassay Immunoluminometric assay
Luminescent 4
(LIA) (ILMA)
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps


2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps

Anticorps

Autres Molécules
Molécules à doser

5
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps


2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des molécules
non liées
Anticorps

Autres Molécules
Molécules à doser

6
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps


2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des molécules
non liées
Anticorps 5. Ajout d’un 2ème anticorps
Molécules à doser

Anticorps de détection

7
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION
Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps


2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des molécules
non liées
Anticorps 5. Ajout d’un 2ème anticorps
Molécules à doser 6. Lavage et retrait des
anticorps en excès
Anticorps de détection

L’anticorps de détection peut être radiomarqué ou fluorescent 8


DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION
Cas des dosages ELISA : Enzyme-Labeled ImmunoSorbent Assay

1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

9
PRINCIPE ELISA
1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection

2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme


détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

10
Substrat
PRINCIPE ELISA
1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de détection

2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une forme


détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

Substrat

Substrat converti

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DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS
COMPÉTITION
Interprétation des résultats :

Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de


radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)

Dosage sans compétition :

Intensité du signal proportionnelle à la


concentration de la substance à doser

Réponse du signal
Domaine quantifiable

12
Concentration
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC
COMPÉTITION

Anticorps (limitant)

Antigènes à doser 13
Antigènes marqués (en excès)
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC
COMPÉTITION
Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de
radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)

Dosage avec compétition :

Intensité du signal inversement proportionnelle à la


concentration de la substance à doser

Réponse du signal
Anticorps (limitant) Domaine quantifiable

Antigènes à doser
Antigènes marqués (en excès)

14
Concentration
MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES :PRINCIPE
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Injecteur

Colonne Détecteur

A B

Pompes

15
Bille de silice greffée
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Polaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Apolaire Phase directe Polaire

Détecteur

Chromatogramme

Intensité
16

temps
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Polaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Apolaire Phase directe Polaire

Détecteur

Chromatogramme

Intensité
17

temps
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Apolaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Polaire Phase inverse Apolaire

Détecteur

Chromatogramme

Intensité
18

temps
DÉTECTEURS
Caractérisés selon leur sélectivité et leur sensibilité
Les plus répandus pour analyse de biomolécules: UV et Fluo

Faisceau lumineux à λ Émission de la


dans ultraviolets lumière

Excitation de
la molécule

Détection UV Détection Fluorescence

Limite de quantification Limite de quantification


de l’ordre µg/mL de l’ordre ng/mL
19
Sensibilité x1000
Spectromètre de masse

Source Analyseur Détecteur

Séparation des ions Comptage des ions


Formation des charges m/z produits
Ionisation des molécules Amplification du signal

Ex: Trappe d’ion

Traitement
informatique
Ex: Electrospray Ex : Quadripôle
20
Source electrospray (ESI)
Ionisation des molécules en sortie de colonne

Cône

Sortie de colonne

Sonde
electrospray

21
VERS
L’ANALYSEUR…

Mesure le rapport m/z d’une molécule m = masse monoisotopique


z = charge

Exemple 1 : Aspirine (acide acétylsalicylique)


-
O OH O O

O CH3 Milieu basique O CH3


+ H+
O O

chargée <0 z=1

9 atomes de Carbone (mC = 12)


8 atomes d’Hydrogène (mH = 1) maspirine = 9 x12 +8 x1 + 4x16 = 180
4 atomes d’Oxygène (mO = 16) Abondance
relative %
179

Rapport m/z = 179/1 = 179


22
m/z
massif
isotopique
Exemple 2 : Mesure le rapport m/z d’une molécule
R

Dérivé de vancomycine
H+
Formule : C80H87Cl3F3N11O24
Masse monoisotopique = 1750
Plusieurs sites basiques

Spectre de masse :

Chargé 2x
m/z = (1750+2)/2 = 876

Chargé 3x
m/z = (1750+3)/3 = 584
Chargé 1x
m/z = 1750+1 =1751 23
Exemple : Analyseur quadripolaire

quadripôle

24
Avec un triple quadripôle
Appareil de référence pour études quantitatives

Source Q1 Q2 Q3 Détecteur

Cellule de collision

Mode d’analyse
 « MS » simple
 « SIM »  sélection d’ion
 « MS/MS » fragmentation
25
 « MRM » mode pour la quantification
Mode d’analyse
ions

Q1 Q2 Q3

Les quadripôles laissent passer tous les ions

- Spécifique

‫« ס‬ MS » simple
 « SIM »  en
Applications sélection d’ion
bioanalyse :
 Études de pureté
« MS/MS » fragmentation
 Quantification
« MRM » mode(concentration de l’ordre du µg/mL)
pour la quantification
26

+ Spécifique
Mode d’analyse
ions

Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini


- Spécifique

 « MS » simple
 « SIM »  sélection d’ion
« MS/MS »
Applications fragmentation
en bioanalyse :
 Quantification
« MRM » mode pour la quantification
Concentrations µg/mL 27
Screening de molécules
+ Spécifique
Mode d’analyse
Énergie de collision : gaz inerte (argon)
Ions
Ions « fils »
Ion
« père »
Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini


Fragmentation dans le deuxième quadripôle
- Spécifique Passage des ions fils dans le troisième quadripôle

 « MS » simple
« MS/MS » fragmentation
« SIM »  sélection
Applications d’ion
en bioanalyse :
« MS/MS »
Études fragmentation protéomique…)
structurales(métabolomique,
28
Quantification
« MRM » mode pour que
(+ sensible la quantification
MS ou SIM)
+ Spécifique
Mode d’analyse
Énergie de collision : gaz inerte (argon)

Ions
Ion Ions
« père » « fils »
Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini


Fragmentation dans le deuxième quadripôle
- Spécifique Sélection d’un ion fils dans le troisième quadripôle

 « MS » simple
Applications en bioanalyse :
 Quantification
« SIM »  sélection d’ion
Concentrations ng/mL
 Screening de
« MS/MS » molécules
fragmentation
29
 « MRM » mode pour la quantification
+ Spécifique
Couplage LC/MS

Spectromètre de masse utilisé comme détecteur

Chromatogramme
Intensité

Temps

Σ Spectres de masse
Abondance relative %

30

Rapport m/z
AVANTAGES – INCONVÉNIENTS

Immunochimie Chromatographie

 Méthodes rapides  Méthodes sensibles


 Méthodes sensibles  LC/MS spécifique
 Forte capacité d’échantillon  Dosages de plusieurs
 Utilisation facile molécules en une analyse

 Purification échantillon
 Pas toujours sélectives nécessaire
 Dosage 1 molécule à la fois  Durée analyse
 Elaboration difficile  Coût appareillage élevé

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APPLICATION : ÉTUDES
TOXICOCINÉTIQUE/TOXICODYNAMIE
Toxicocinétique Toxicodynamie

Dose Réponse
Profils de concentration biologique

Etudes de
Quantification du contaminant biomarqueur
(et métabolites)
10000
6 1000
10000 1000

100

10

4 100
1000
1
0 6 12
Concentration (ng/mL)

100

10
2 10
1

0
0 50 100 150 200 250 300 0 1
Time (h)

44 46 48 50 52 54 56 58

Administration
Collecte Analyse
Toxicodynamie
Toxicocinétique

32
ADMINISTRATION
 Produit chimique, produit naturel isolé, etc.
 Choix d’un solvant d’aministration
 Documenter la stabilité du produit
 Attention aux substances peu solubles
 Verifier les doses administrées (analytique)
 Produit de formulation
 Essai pilote
 Doses commerciales (produits pharmaceutiques)
 Peu être inexacte
 Impuretés (± 5%)
 Se référer à la directive pour les produits pharmaceutiques Good Manufacturing
Practice (GMP)
 Vérifier les doses administrées (analytique)
 Mode d’administration
 Perfusion, Bolus….
 Doses simples, multiples
 Voie d’administion (IV reference, orale….)
33

A définir dans le protocole expérimental


STRATÉGIE DE PRÉLÈVEMENT

Pour chaque spécimen collecté il faut garantir :


 Un bon prélèvement
 Ponction ou cathéter (prélèvement sanguin)
 Site de prélèvement (veine, artère…)
 Temps de prélèvement (durée, cycle circadien, …)
 Un bon traitement ou préparation des spécimens
 Sang total, plasma, serum…
 Tubes de collecte (anticoagulant, type de tube…)
 Conditions de centrifugation
 Filtration (urines)
 Une bonne conservation pour s’assurer de la stabilité des substances et de
leurs métabolites
 Température de conservation (-20°C, -80°C…)
 Durée de conservation avant analyse

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A définir dans le protocole expérimental
ANALYSE ET VALIDATION DE MÉTHODES
10000

10000 1000

100

10
1000
1
0 6 12

Concentration (ng/mL)
Valeurs des concentrations les plus fiables possibles
100

10

PARAMÈTRES 0
0 50 100 150
Time (h)
200 250 300

FONDAMENTAUX
 Sélectivité/spécificité
 Linéarité
 Exactitude
 Précision (répétabilité/reproductibilité)
 Sensibilité
 Stabilité

Certifie que la méthode est appropriée pour une utilisation routinière

Texte de Référence :
Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of Health and
Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and 35
Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), May 2001

http://www.labcompliance.com/info/links/methods/guidelines.aspx.
SÉLECTIVITÉ/SPÉCIFICITÉ

Définitions :
Sélectivité : Capacité à différencier et quantifier un analyte en présence d’autres substances
dans la matrice
Spécificité : Propriété de la méthode analytique de convenir exclusivement à l’analyte avec
la garantie que le résultat ne provient que de l’analyte. (absence interférence)

Exemple :

Aire à LOQ
Réponse

Aire interférence < 5% LOQ

36
T (min)
Linéarité : courbe de calibration
Définition : Rapport entre les concentrations connues et les réponses analytiques
expérimentales (observées).

Objectif : Déterminer les concentrations des échantillons

Chromatogramme :
Analyte

SI

37
 Utiliser un standard interne et utiliser le ratio :
Origine de l’erreur : Précision et exactitude

o Erreur systématique (non aléatoire)


 Biais
 Impossible de le corriger
C’est l’exactitude (accuracy)
o Erreur aléatoire
 On peut l’évaluer avec des statistiques
C’est la précision

Illustration avec des cibles

38
Méthode précise et Méthode peu précise Méthode précise et Méthode peu précise
exacte et exacte biaisée et biaisée
Mesure de l’exactitude

o L’exactitude d’une méthode analytique est l’étroitesse de l’accord entre la moyenne


d’une série de concentration obtenue par le modèle et la concentration réelle de l’analyte.

 Points QC « Quality Controle »


 5 QC à 3 niveaux de concentrations:
(Bas (3*LOQ), Milieux, Haut)

o Comparaison entre moyenne des concentrations calculées et valeur théorique


Moy Cpréd - Cnom
Exactitude (%) = 100 x +100 39
Cnom

Critères d’acceptabilité : 85 % < Exactitude <115 %


Mesure de la précision
o La précision d’une méthode analytique mesure l’écart de chaque mesure individuelle par
rapport à la moyenne des mesures d’un volume d’échantillon unique et homogène

 Points QC « Quality Controle »


 5 QC à 3 niveaux de concentrations
 Précision intra-jour (répétabilité)
 Précision inter-jour (reproductibilité)
 Evaluation sur 3 jours
 Calculée avec le coefficient de variation
(CV%)
X1 X2
Écart type
CV % = X 100
Moyenne

o Pour une précision intra-jour et/ou inter-jour sur plusieurs concentrations :


Analyse de variance (ANOVA)
40

Critères d’acceptabilité : CV < 15 %


Sensibilité : LOD et LOQ
Définition :
o la limite de détection (LOD) est la plus petite concentration de l’analyte pouvant être
détectée et différencier du bruit de fond. En général, elle est évaluée à 3 x le bruit de
fond du signal.

o la limite de quantification (LOQ) est la plus petite concentration de l’analyte


pouvant être quantifiée avec une exactitude et une précision appropriée.
Domaine d’analyse :

LOD LOQ

Non LOD
Domaine Domaine
détectable détectable quantifiable

Mesure de la LOD :
 Injection de six blancs matrices et mesure de la réponse
 Calcul de la concentration en retour moyenne x 3 = LOD
Mesure de la LOQ :
41
 Injection de 5 points de LOQ et calcul des concentrations
 Critère d’acceptabilité : CV < 20 % et exactitude entre 80 et 120 %
Stabilité
La stabilité de l’échantillon doit être évaluée à toutes les étapes précédent l’analyse.

Critère d’acceptabilité :
Il n’y a pas de valeurs réglementaires

On s’autorise une
 Stabilité des solutions mères et filles variation de 5%

 Stabilité à cours terme

 Stabilité à long terme


On s’autorise une
 Cycle de congélation-décongélation variation de 15%

 Stabilité post – extraction


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Dosage en routine

Chaque jour de dosage :

 1 gamme + 2 séries de QC à trois niveaux de concentrations par jour.

 1 série valide la gamme du jour et une série en fin de dosage valide les
échantillons

Critère d’acceptation :
 75% des points de la gamme doivent avoir une variation ± 15% par rapport
à leur valeur nominale (sauf à la LOQ ± 20%)
 2 QC sur 6 QC peuvent être au-delà de ±15% de variation (mais pas au
même niveau de concentration)

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EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Fipronil : Insecticide à usage phytosanitaire ou vétérinaire

F O N
F S

F
N
H2N
N
Interdit en France en 2004
Cl Cl
Substance vétérinaire la plus
commercialisés au monde
F F
F

Métabolite principal : Fipronil sulfone (-SO2CF3)

Potentiel perturbateur endocrinien : Effet sur hormones thyroïdiennes

Risque pour la santé humaine lié à l’exposition au fipronil?


44
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Objectif : Evaluer les effets du fipronil et de son métabolite sur les hormones
thyroïdiennes
Toxicocinétique Toxicodynamie
Dose Réponse
Profils de concentration biologique

Protocole : Gavage 14 jours


Fipronil
Fipronil sulfone
Administration Solvant
IV ou VO Dosage Fipronil et Administration IP
Fipronil métabolite par Thyroxine (T4) à Dosage T4
Fipronil sulfone LC/MS chaque groupe par RIA
Plasma Plasma
Solvant
6 jours (IV) 24H
9 jours (VO) 8 pts/cinétique
10 pts/cinétique
Réponse biologique : Clairance
IV : Paramètres TK et métabolisme T4
(t1/2, CL…)
Rats THX + T3 (SC) VO : Biodisponibilité Dosage T4 et
Cathétérisés métabolites par
LC/MS 45
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TK : A: voie intraveineuse B: voie orale

Fipronil Fipronil

Fipronil sulfone Fipronil sulfone

46

Fabs ≈ 1 quelque soit la molécule


EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TD (dosage RIA) :
* A: T4 totale

* P < 0.05
** P < 0.01

**
B: T4 libre
**

* P < 0.05
** P < 0.01

47
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TD (dosage LC/MS) :
Permet de doser la T4 et ses métabolites
Concentrations plasmatiques (ng/mL)

Concentrations plasmatiques (ng/mL)


T4 T3 Dernière SC T3

Temps (Hr) Temps (Hr)


Concentrations plasmatiques (ng/mL)

T2 Modification du profil de la T4 et de ses


métabolites en présence de Fipronil ou de
Fipronil Sulfone

Importance d’évaluer les molécules mères 48


Temps (Hr)
mais aussi les métabolites formés