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Ministère de la santé et de la réforme hospitalière

Faculté de médecine d’Alger –Département de pharmacie

Validation analytique
en toxicologie

Présenté par Dr R. ZAMOUM Année universitaire: 2011-2012


Définition
« La validation est la confirmation par examen et
l'apport de preuves objectives du fait que les
prescriptions particulières en vue d'une utilisation
prévue déterminée sont remplies. »

Le laboratoire doit valider:


-Méthodes non normalisées,
-Méthodes conçues/développées par le laboratoire
-Méthodes normalisées employées en dehors de leur domaine d'application prévu,
-Méthodes normalisées modifiées
But de cette présentation:
- Présenter les différents critères de validation d'une méthode
de dosage en bio-analyse, en vue de son application à
l'analyse d'échantillon en routine (études toxicologiques,
suivi thérapeutique).
Référentiels:
• Les articles relatifs à la Conférence de Washington(1990)
• Le document SFSTP : «Guide de validation analytique-Rapport d’une commission SFSTP »(1992)
• Le document SFSTP «Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques : stratégie
de validation. Rapport d’une commission SFSTP »(1997)
• Le document SFSTP : «Validation des procédures analytiques quantitatives : Harmonisation des
démarches” (2003 & 2006 )
• Le document NE ISO 17025(2005)
• ICH Guidelines : « validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1)» (2OO5).
• ICH Guidelines (Q2A&Q2B)
• Les documents FDA « Guidance for industry-analytical procedures and methods validation-
chemistry, manufacturing »
• Guideline EMEA sur la validation des méthodes bio-analytiques (Juin 2011 devenant effectif en
fév. 2012)
• Pharmacopée européenne /américaine
Pré-requis de la validation
1. Qualification de l'équipement analytique:
Document concernant la validation de l'équipement par le
fournisseur,
Fiche de vie et
Opérations de maintenance

2. Etalonnage du matériel:
Certificat de conformité du fournisseur,
Fiche de vie
Opérations d’étalonnage /calibration
Pré-requis de la validation
3. Qualification du personnel:
- Formation initiale
- Formation continue: Recyclage périodique des connaissance
- Evaluation des compétences périodique et permanente.

4. Maîtrise de la documentation:
 Méthodes de références normalisées.
 Méthodes d'essai et/ou d'étalonnage
 Normes/Documents normatifs.
 Dessins, logiciels, spécifications, instructions et manuels.
Pré-requis de la validation
5. Connaissance des performances de la méthode
analytique

Bibliographie
et/ou Connaissance des performances
expérimentation de la méthode analytique
sur site

OUI NON

- Type de fonction de réponse


- Limites de quantification Pré validation
- Intervalle de dosage
Protocole de validation
Types de validation:
1. Validation complète
2. Validation partielle
3. Validation croisée

Validation croisée Validation partielle Validation complète

-Transfert de -Dosage d'un analyte pour la


Deux méthodes méthode analytique entre 1ère fois.
analytiques différentes laboratoires,
-Modification d'appareillage ou de - Utilisation de la méthode
sont utilisées pour logiciel de gestion, mise au point pour le
-Changement d'espèce pour une dosage de la molécule mère
générer des données matrice donnée ou un changement au dosage des métabolites.
dans une même étude. de matrice dans une même espèce.
Protocole de validation

1. Validation complète

Protocole de validation proposé aujourd’hui


Protocole de validation
2. Validation partielle

- Étude de la relation concentration / réponse.

-Vérification de l'exactitude et de la fidélité.


Protocole de validation
3. Validation croisée

Comparaison statistique des paramètres de validation de chacune des méthodes.

Autres terminologies:

- Validation initiale-validation permanente.


- Pré validation-Validation.
Protocole de validation
- spécificité-sélectivité ; Critères de validation généraux:
- specificity-selectivity,
Spécificité
- fonction de réponse (courbe d’étalonnage) - response function (calibration curve),
Linéarité
- linéarité ; Exactitude - linearity,
Fidélité
- fidélité (répétabilité et fidélité - precision (repeatability and intermediate
Intervalle d'application
intermédiaire) ; precision),
Limite de détection
- justesse ; Limite de quantification
- trueness,
- exactitude ; - accuracy
- limite de détection (LD) ;
Critères de validation spécifiques:
- limit of detection (LOD),
Rendement d’extraction
- limite de quantification (LQ) ; - limit of quantitation (LOQ),
Stabilité des solutions
- intervalle de dosage ;  Robustesse - assay range,
- sensibilité. Effet de dilution - sensitivity.
:Evaluation de la méthodes

- Etapes essentielles:
1- Répétabilité
2-Linéarité
3- Reproductibilité intra laboratoire

- Etapes à mettre en œuvre en fonction des caractéristiques particulières de


la méthode:
1- Robustesse
2-Spécificité

Etapes facultatives:
1- Sensibilité
2- Limite de détection
3-Limite de quantification

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES – OIV


MA-F-AS1-06-PROVAL
Protocole de validation
Définitions:
Spécificité
Spécificité est sa capacité
exprime l’étroitesse
à établir
l’intérieur
de l’accord
d’unentre
(degré
de manièrecertainlede
résultat
intervalle
univoquedispersion,
d’essai
de dosage
l’existenceetde
la la
Linéarité
Linéarité d’obtenir
valeur
coefficient
de des
substance référence
àde résultats
variation)
analyser acceptée,
endirectement
entreaussi
présenceuned’autres
série
appelée
proportionnels
decomposants
mesures
« valeurà la
Exactitude
Exactitude quantité
conventionnellement
provenant (exemple
potentiellementde multiples
: concentration)
vraie
présents. prises
». d’un même
en analyte
échantillon
dans
Fidélité
Fidélité l’échantillon.
homogène (résultats d’essais indépendants) dans des
conditions
est
LDlaest
région prescrites.
la plus entre
petitelesquantité
niveaux desupérieur
l’analyteetdans
inférieur
un
Intervalle
Intervalle de
d'application
d'application
dosage
Limite
Limite de
de détection
détection LD
échantillon
(ces valeurs pouvant
incluses)être pour détectée,
laquellemais
il a été
nondémontré
quantifiée
comme
que la procédure
une valeur estexacte
appropriée
dans les
quant
conditions
à son exactitude
expérimentales
Limite
Limite de
de quantification
quantification LQ
décrites de
(justesse + fidélité)
la procédure.et sa linéarité.

LQ est la plus petite quantité de l’analyte dans un


échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée
comme une valeur exacte dans les conditions expérimentales
décrites de la procédure.
Pré validation Optimisation

- Vérifier la spécificité avant d’entreprendre la phase de validation de la procédure.

- Définir la fonction de réponse (linéaire ou non linéaire, transformation mathématique,

pondération) qui sera utilisée comme système d’étalonnage lors de la validation,

- Définir le seuil de détection (si nécessaire),

- Estimer le ou les seuil(s) de quantification (selon les procédures),

- Évaluer l’intervalle de dosage ainsi que le nombre des points de la gamme d’étalonnage,

-Déterminer éventuellement le rendement d’extraction


Méthodologie

Approche pratique Approche statistique

Exploitation et interprétation
Mise en œuvre du protocole
des résultats
Approche pratique

(Pré validation ou optimisation)

1- Spécificité-sélectivité

Sélectivité vis-à-vis des Sélectivité vis-à-vis des


composants endogènes composants exogènes

6 Blancs « matrice » de sources différentes

- milieux biologiques: métabolites de substances


- milieux biologiques: associations
endogènes, constituant de la matrice.
médicamenteuses, métabolites.
- Autres milieux: impuretés, produits de
- Autres milieux: impuretés, alliages
dégradation
Approche pratique

(Pré validation ou optimisation)

2-Fonction de réponse: Y= f (X)


Elle traduit, à l’intérieur de Y: réponse; de
l’intervalle X: dosage,
concentration
la relation existant entre la réponse
(signal) et la concentration (quantité) en substance à examiner dans l’échantillon.
-Choix des concentrations -Analyse des échantillons
-La fonction
Choix de lade réponse monotone la plus simple-Recueil
matrice qui exprime cette relation
des résultats est appelée
(réponses)
-«Choix ded’étalonnage
courbe la méthode d’analyse
». -Établissement de la droite d’étalonnage
-Prétraitement ou non de la matrice - Calcul des paramètres de la droite

Approche statistique
Pré validation
Approche pratique
Approche pratique
(Pré validation ou optimisation)

3-Seuil de quantification
La plus basse concentration de la courbe d’étalonnage peut être acceptée comme
limite de quantification si les conditions suivantes sont réunies:
-Le signal de l’analyte à la limite de quantification inférieure doit être au minimum 5
fois le signal du blanc S/N≥ 5.
-La justesse, en terme de biais relatif, et la fidélité devraient être ± 20%. «EMA- Guideline on
bioanalytical method validation; 2011»

Selon RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES (Guide de validation – Contrôle


qualité):

•Approche sur blanc


•Approche par l’étude de linéarité
•Approche graphique
3-
1-
2- Approche
Approche sur
parblanc:
graphique:
l’étude de linéarité:

Cette
On utilisera
Utiliserdémarche
la moyenne
peutobtenus
les résultats s’appliquer
des valeurs
lors pour
de obtenues
les méthodes
l’étude deMblanc d’analyse
linéarité et l’écart
qui ontqui
type
fournissent
permisSblanc calculé
un
de calculer
pour
enregistrement
la détermination
les paramètres graphique
de de la(chromatographie…)
la fonction limite de détection
d’étalonnage y = a+qui
présentant
sera conventionnellement
b.x un bruit de fond.
multiplié
Les limitespar
sont
10 pour
estimées
obtenir
à partir
la valeur
d’unelaétude
limitedudebruit
quantification
de fond. LQ.

- Si Méthode d’analyse ne présente pas de bruit de fond.


- Blanc
- Résultat réactif
biaisé ou blanc
lorsque matriceest
la linéarité (n≥10).
calculée sur une échelle très large de valeurs de
-Écartde
matériaux type non nulet dont les résultats des mesures présentent des écarts types
référence,
- Si écart type nul => solutions de faible concentration proche du blanc
variables.

 Étude de linéarité restreinte (proche de 0).


 De dispersion plus homogène.
Approche pratique
Approche pratique
(Pré validation ou optimisation)

4- Intervalle de dosage:
A cette étape, l’intervalle de dosage correspond aux concentrations choisies par
l’analyste (Domaine de travail) qui doit être vérifié par calcul de certains paramètres
lors de l’étape de validation (Profil d’exactitude).

- Niveaux de concentration des- Niveaux


échantillons
de concentration
prévisibles des échantillons inconnus =>
=> adapter l’intervalle de dosage
adapter
aux échantillons
l’intervalle de
+ QC
dosage aux échantillons + 2 QC
(restreindre ou élargir) (restreindre ou élargir)

- modification de l’intervalle => validation partielle


(fonction de réponse, justesse, fidélité)
Approche pratique

(Pré validation ou optimisation)

5- Rendement d’extraction
- n≥ 3.
- Mesure d’échantillons chargés avec une quantité connue en analyte puis extrait.
- Mesure d’échantillons (matrice) extraits puis chargés;
- Calcul du rapport des signaux.
Approche pratique

(Validation)

6-Courbe d’étalonnage:
En pratique, il s’agit d’exploiter les résultats obtenus lors de l’établissement
de la courbe d’étalonnage

1. Au moins six niveaux de concentrations (k≥6)+ 1 blanc


2. Etablir la relation réponse-concentration
3. Calcul des paramètres de calibration (Pente, ordonnée à l’origine et coefficient de corrélation)
Approche pratique

(Validation)

7- Linéarité:
L’exigence de linéarité s’applique aux résultats, pas aux réponses

Xc = f (Xi )
Xc: Concentration calculée ; X: concentration théorique

C’est un pré requis à l’estimation de la justesse.

À l’inverse, l’existence d’une relation linéaire entre la concentration estimée et la


concentration introduite n’implique pas que la méthode soit juste.
Approche pratique

(Validation)

8- Justesse: Inter- et intra-série

En Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique, il n’existe pas, à de rares


exceptions près, d’échantillons de contrôles raccordés sur le plan métrologique à des
étalons internationaux ; il est donc impossible de parler stricto sensu de “valeur vraie” et
par là-même de justesse.

En l’absence de matériau de référence certifié, on pourra utiliser des échantillons utilisés


pour des CQE réguliers et dont la commutabilité aura été vérifiée ou prouvée. Il est
souhaitable (mais pas obligatoire) d’utiliser des échantillons de différentes origines
commerciales.

Aide à la validation des méthodes en Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique; Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII,
n° 3, supplément 1, 2005
- Exploitation des résultats de la courbe d’étalonnage
- Comparaison entre la moyenne arithmétique des concentrations
obtenues pour un même niveau et la concentration introduite du
même niveau.
- s’exprime en Biais (absolu/relatif ).
Approche pratique

(Validation)

9- Fidélité: ) Répétabilité ; fidélité intermédiaire et reproductibilité (

9.1 – Répétabilité:

- Même échantillon.
- Même analyte.
-Conditions identiques (opérateur, lots de réactifs, instrument, calibrateur).
- k≥ 2.
-d ≥ 6.

k: nombre de niveaux de concentration.


d: nombre de déterminations.

Aide à la validation des méthodes en Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique; Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII,
n° 3, supplément 1, 2005
Approche pratique

(Validation)

9- Fidélité:
9.2 - Fidélité intermédiaire:

- Même échantillon.
- Même analyte.
-Conditions différentes (opérateur, réactifs, appareillage, calibrages , gammes
d’étalonnage, jours)
- k≥ 2.
-d ≥ 6.

k: nombre de niveaux de concentration.


d: nombre de déterminations.

Aide à la validation des méthodes en Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique; Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII,
n° 3, supplément 1, 2005
Approche pratique

(Validation)

9- Fidélité:
9.3 - Reproductibilité:

- Même échantillon.
- Laboratoire différent.

Aide à la validation des méthodes en Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique; Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVII,
n° 3, supplément 1, 2005
Illustration de l’interprétation de la notion d’exactitude

Signification de l’erreur totale Référence

erreur systématique+erreur aléatoire Statistique


(biais + écart type)

Justesse+fidélité=exactitude ISO

Erreur totale? ICH


?=exactitude+fidélité
exactitude=justesse

STP PHARMA PRATIQUES - volume 13 - N° 3 - mai/juin 2003


Contamination
Une étude des contaminations inter-échantillons sera effectuée de la façon suivante :
Après rinçage de l’appareil, un échantillon élevé (ou positif fort) sera analysé 3 fois
consécutivement (H1, H2, H3 de moyenne H) suivi d’un échantillon bas également
passé 3 fois (B1, B2, B3)
Note : Compte tenu de l’importance clinique de certains paramètres, le niveau de la
contamination doit être maintenue à zéro ou entraîner des règles de réanalyse
argumentées.

Le pourcentage de contamination entre les échantillons peut être calculé selon la


formule suivante :
Corrélation de méthodes
Les concentrations des échantillons de validation doivent être choisies de façon à couvrir
l’étendue du domaine d’analyse.
Chacun des n échantillons de validation (n > 5), est analysé p fois (p > 3) par la méthode
A et par la méthode B.

1. A partir des valeurs observées, tester, pour chaque méthode, l’homogénéité des
variances de chaque échantillon (soit n variances pour A et pour B) selon par exemple
un test de Cochran, de Levene ou de Hartley, etc...(Test d’homoscédasticité)

2. Tester l’égalité des variances entre les deux méthodes selon un test F à (p(n-1)) ddl et
(p(n-1)) ddl (Comparaison de deux variances par un test de Fisher).

3. Calculer les différences des résultats obtenus pour chacun des échantillons :
Calculer la moyenne de ces différences ainsi que sa variance et tester l’égalité de cette
différence moyenne à zéro selon un test t de Student, avec t à (p-1) ddl (Comparaison de
moyenne d’échantillons appariés).
Méthodologie

Approche
Approchestatistique
pratique Approche statistique

Exploitation et interprétation Exploitation et interprétation


Mise en œuvre du protocole
des résultats des résultats

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