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Carolina Rejas Gallegos

Prof. Francisco Aguilera
6 de Noviembre de 2009
4

_ Yescribir la biología del virus influenza A
H1N1 (su estructura y modo de infectar).

_ Yescribir la técnica de PCR en tiempo

real, y su aplicación al diagnóstico del
virus influenza A H1N1.

_ Evaluar las ventajas de la PCR en tiempo

real sobre la PCR convencional, sobre
otras formas de detección del virus.
! 
 
_ El virus de la influenza A H1N1 ha surgido
en el presente año

_ Muchas personas han sufrido la

enfermedad, y muchas otras han muerto
por la infección

_ Se requiere un método sensible y

específico, rápido, exacto _ PCR en tiempo
real
 

_  nfecciones virales respiratorias _ morbilidad a
nivel mundial, preferencia por ancianos y niños

_ Recombinación de genes virales _ A H1N1

Rápida infección, sobre 2000 en Chile en pocas
semanas

_ Síntomas inespecíficos al comienzo, agravan al

pasar las horas/días.
å
 
 

_ Familia 4
 

_ Géneros A, B, y C

_ Virus contenido en 8 cadenas RNA,

envuelto en capa lípidica, forma esferoidal
16 x 9
subtipos
_ Proteína de envoltura (H) _ 16H
_ Prot. de liberación de virus (N) _ 9N
å
 
 

_ Ariple recombinación genética:
Aviar _ genes: PB2 y PA
Porcina _ genes: HA, NA; MP, NP, y NS
Humana _ gen: PB1
 

_ Hemaglutinina se
acopla al ácido siálico

_ Célula fagocita al virus

mediante endocitosis

_ Atrapa proteasas
 

_ †a célula bombea ácido

hacia el endosoma, a
través del canal M2

_ Cambios en la
Hemaglutinina: sus
cabezas globulares se
retraen
 

_ nión y fusión con la

membrana celular

_ Se abre un poro

_ Pasa el RNA del virus

a través del citosol
llegando al núcleo
 
_ Polimerasas copian el
mRNA
_ Producción de nuevas
proteínas virales
_ Migran a la superficie,
la N corta ác. Siálico
de la mb.
_ Virus son liberados
con la capa lipídica de
la mb. celular
A 
_ Aoma de muestra
frotis o lavado faríngeo, o nasofaríngeo; lavado
bronquiolo-alveolar; lavado traqueal

_ Aransporte
 nmediato _ 4°C
Almacenado _ -80°C
D 
_ RA-PCR en Aiempo Real _ Específica

_ Cultivo viral _ resultados positivos

requieren otra técnica.

_ Pruebas con antígenos virales

 nmunofluorescencia _ resultados dependen de
la calidad de la muestra.

_ Pruebas serológicas _ para epidemiología


!
A

PCR Aiempo Real PCR convencional
_ Cuantitativa _ Cualitativa
_ Mide amplificación en _ Caracteriza
fase exponencial amplificación en fase
_ Yetección mediante Plateau
fluorescencia _ Yetección mediante
electroforesis

!
A


_ 4neStep Real Aime PCR

Aranscripción inversa y amplificación en un
solo paso

_ A oStep Real Aime PCR

Aranscripción inversa previa a amplificación
è
!
A


_ Fase Exponencial _ amplificación exponencial

Ahreshold. Nivel de fluorescencia superior al background
Cycle Ahreshold.  ndica el ciclo en que se alcanzó
Ahreshold

_ Fase †inear _ depende de la cinética de reacción

de cada ensayo

_ Fase Plateau _ †a reacción ha cesado. El material

que quede es degradado.
è
_ Agentes intercalantes
SYBR Green  : Alta sensibilidad, no requiere
sonda, baja especificidad

_ Sondas de hibridación específicas

Sondas de hidrólisis o Sondas AaqMan
Molecular beacons
Sondas FREA
 SYBR Green  

Hidrólisis o AaqMan
è

_ Aermociclador con lector de fluorescencia,
además permite:
Amplificación y detección de YNA o RNA

PCR múltiple

Cuatificación de YNA
o RNA

Análisis de curvas
de disociación



!

Primers y Sondas Secuencia ( 5¶ _ §¶)
InfA Forward GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C
InfA Reverse AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
InfA Sonda1 TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG
SW InfA Forward GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG
SW InfA Reverse GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC
SW InfA Sonda2 CYA CTG CAA GCC CA´T´ ACA CAC AAG CAG GCA
SW H1 Forward GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA
SW H1 Reverse CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC
SW H1 Sonda2 CA GAA TAT ACA ³T´CC RGT CAC AAT TGG ARA A
RnaseP Forward AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
RnaseP Reverse GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
RnaseP Sonda1 TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG



!

_ Condiciones de amplificación del
termociclador

Temperatura y
Proceso
Tiempo

Transcripción reversa 50ùC por §0 min.

Activación del inhibidor de Taq 95ùC por 2 min.

Amplificación de PCR (45 95ùC por 15 seg.

ciclos) 55ùC por §0 seg.*
!
_ Aécnica muy costosa, debido a los
reactivos y equipos necesarios

_ Su alto costo no permite implementar la

técnica en laboratorios públicos.

_ Para la influenza A H1N1 el costo es alto,

pero también lo es el beneficio.
!

_ El virus influenza A H1N1 fue muy
agresivo en su aparición debido a que no
se conocía como a la influenza estacional
_ †a detección del virus se vuelve urgente
para tomar medidas paliativas o curativas
_ El diagnóstico del virus mediante PCR en
tiempo real, es bastante caro, por lo que
no es posible habilitar el sistema público
con la técnica, y solo se reserva para
investigación o laboratorios privados.


v1] Hoffman, E. et al. niversal primer set for the full-length amplification of
all influenza A viruses. Arch Virol. 29 de Agosto de 2001. 146: 2275 ±
2289.
v2] Michaelis, M. Wilhem Y., H. Cinthial Jr., J. Novel s ine-origin influenza A
virus in humans: Another pandemic knocking at the door. Med Microbiol
 mmunology. 20 de Junio de 2009. 198: 175 ± 183.
v3] Zheng, K. SongNian, H. AianXian, †. Genome evolution of novel influenza
A (H1N1) viruses in humans. Chinese Science Bulletin. Julio de 2009. Vol
54, N° 13: 2164 ± 2167.
v4] Schnitzler, S. . Schnitzler, P. n update on s ine-origin influenza virus
A/H1N1: a revie . Virus Genes. 7 de 4ctubre de 2009. 39: 279 ± 292.
v5] http:// .ne scientist.com
v6] WH4 (World Health 4rganization). CYC protocol of realtime RA-PCR for
influenza A (H1N1). 6 de 4ctubre de 2009. Yisponible en
http:// . ho.int
v7] Ministerio de Sanidad y Política Social, Gobierno de España.  nfección por
el virus pandémico (H1N1) 2009, Protocolo de diagnóstico virológico.
Septiembre de 2009. Yisponible en:
http:// .msc.es/profesionales/saludPublica/gripeA/docs/ProtocoloVirolo
gico.pdf


v8] Applied Biosystems. Real Aime PCR. Yisponible en
http:// 3.appliedbiosystems.com
v9] Sugden, Y. Quantitative PCR. Medical Biomethods Handbook. Ed. Humana
Press. 2005. Cap. 25: 327 ± 345.
v10] Spackman, E. Suarez, Y. †. Aype A influenza virus detection and
quantitation by Real-Aime RA-PCR. Avian  nfluenza Virus (Methods in
Molecular Biology). Ed. Humana Press. 2008. Cap. 25: 327 ± 345.
v11] Costa, J. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
En: Puesta al día en métodos microbiológicos en el diagnóstico clínico, cap
12: 88 ± 93. Yisponible en
http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t12.pdf
(consultado el...
v12] Yiario †a Aercera. 5 de Junio de 2009. Yisponible en
http:// .latercera.com
v13] Yiario El Mercurio. 6 de Junio de 2009. Yisponible en
http:// .emol.com
v14] Fondo Nacional de Salud (F4NASA). Yisponible en http:// .fonasa.cl