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HYGIENE DU PERSONNEL 1
Hybridation moléculaire 
L'hybridation moléculaire désigne l'association qui peut avoir lieu entre deux
acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui conduit
à la formation d'un double brin ( ou duplex ). Cette association s'effectue par
l'établissement de liaisons hydrogènes spécifiques entre les bases.

La formation et la stabilité des duplex dépendent de nombreux facteurs en plus


de la composition en bases : longueur des duplex, complexité de la
séquence…etc.

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L'hybridation est à la base de nombreuses techniques de
biologie moléculaire impliquant la mise en présence d'au moins deux
brins simples d'acides nucléiques dans des conditions physico
chimiques précises. Le brin, dont on connaît au moins une partie de
la séquence, est une sonde, l'autre brin, celui que l'on souhaite
caractériser constitue la cible. L'un des deux brins est marqué par
couplage chimique avec une molécule pouvant générer un signal
décelable. 

Cette méthode a été initialement décrite par Edwin.M.


Southern en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des
fragments d'ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires marquées par un radioisotope. 
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Pour le cas de deux brins complémentaires de la même molécule d'ADN (brins
homologues) on parle de renaturation (hybridation à 100%).
L'hybridation moléculaire est utilisée surtout dans la détection de l'homologie entre les
molécules d'ADN de sources différentes.

Hybridation des acides nucléiques (Passarge, 2007). 5


Hybridation des acides nucléiques (Passarge, 2007).
Paramètres influençant sur le Tm de l'ADN
T°C, %GC, Force ionique (cad [sel]), longueur ADN, % formamide,
% mismatch

Tm = 50% de dénaturation de l'ADN bicaténaire ; + Tm élevé, +


hybride stable alors il faudra plus de chaleur pour séparer les

doubles brins. Donc +Tm bas, + hybride instable.

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Tm: La températue de fusion(melting temperature) correspond à la
température de dénaturation de 50% de l'ADN bicaténaire 7
%GC : + %GC élevé, + Tm élevé

Force ionique : cad la concentration en ions dans le milieu. Les sels


chargés + vont stabiliser l'ADN chargé -. + sel, + le duplex est stable
et + Tm va être élevé.

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Taille de l'ADN : cela a de l'influence notamment pour les petits
fragments. + ADN grand, + ADN stable ; + ADN petit, + ADN instable

Molécules qui dénaturent l'ADN : Formamide et Urée. On s'en sert pour


faire diminuer le Tm d'un duplex.

Les défauts d'appariement : les mismatchs influencent également le Tm


d'un duplex.

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Formules utilisées pour calculer la Th
 

Formule de Wallace: Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th = Tm-5

La formule de Wallace permet de déduire la Th des petits oligonucléotides


(jusqu’à 20pb, Ex. Les amorces).

on peut calculer facilement le Tm :


1 AT = 2°C ; 1 GC = 4°C
ex: si 20 pb avec 10[AT] = 2°C x 10 = 20°C et 10[GC] = 4°C x 10 = 40°C
le Tm = 20 + 40 = 60°C

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Pour les oligonucléotides avec N < 100 nucléotides on utilise la formule suivante
en tenant compte de la concentration du sel, des mésappariements et de la
concentration de formamide:

Tm = 16.6log[Na+] + 0.41(%(C+G))+ 81.5-(675/N)-%mismatch- 0.65% de


formamide 

Dans les conditions réactionnelles standards la Tm pour les longs séquences


(>100):

Tm = 69.3 + 0.41(%(C+G))
La formule globale:
 
Tm = 81.5 + 16.6log[sel] + 0.41[%(C+G)] - % mis-appariement – (500/N) – 0.65%
(formamide).

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Caractéristiques générales 
Une sonde nucléotidique peut être une séquence d' ADN ou d'ARN, mais
obligatoirement monobrin. Sa taille est très variable : oligonucléotide de
20-30 nucléotides ou à l'opposé de plusieurs centaines de nucléotides.
La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché.
Dans un mélange complexe où s'effectue l'hybridation moléculaire, la
sonde doit être facilement repérable grâce à un marquage avec un
radioisotope (marquage chaud), mais il existe également des sondes
appelées sondes froides sans marquage par un radioisotope.

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Obtention d'une sonde 
Il existe plusieurs possibilités pour obtenir une sonde nucléotidique :
 
- Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse
chimique, si la séquence de l'ADN à repérer est connue. Si elle est
inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et remonter
grâce au code génétique à la séquence d'ADN.

- Une sonde peut être un ADNc. Une partie seulement du ADNc est
utilisée (après action d'enzymes de restriction et clonage des
fragments obtenus). 
- Une sonde peut être théoriquement du mARN.

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L'hybridation moléculaire avec la sonde 

L'hybridation moléculaire sonde-fragment d'ADN à repérer


nécessite des conditions physico-chimiques parfaites (tampon, pH,
température, etc..). Ces conditions sont appelées la stringence.

Plusieurs facteurs peuvent également intervenir comme la


longueur de la sonde et la complémentarité sonde-fragment avec
possibilité de mauvais appariements. 

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Les étapes successives de cette technique sont les suivantes :

1- Extraction de l'ADN génomique

2- clivage enzymatique de restriction

3- Séparation électrophorétique des fragments d'ADN par

électrophorèse dans un gel d'agarose. 

4- dénaturation dans le gel des fragments de restriction

5- transfert sur support (membrane de nylon ou nitrocellulose)

par capillarité (buvardage)

6- fixation de l'ADN sur la membrane (mb. nitrocellulose, mb.nylon)

et hybridation avec une sonde dénaturée marquée

7- lavage et révélation (autoradiographie)

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1- Extraction de l'ADN génomique. 
Cette extraction s'effectue à partir des leucocytes circulants par exemple
obtenus à partir de sang total.

2- Digestion par des enzymes de restriction différentes


L'ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes (dans le
tube 1, on réalisera une digestion par l'enzyme 1; dans le tube 2, une digestion
par l'enzyme 2 ; etc....). On peut, bien entendu, réaliser des digestions par deux
enzymes dans un même tube. Dans ces conditions, on obtient un très grand
nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une
partie ou à la totalité du gène étudié.

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3- Séparation électrophorétique des fragments d'ADN par électrophorèse dans un gel
d'agarose. 
Après séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN
bicaténaires obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des
fragments par un traitement alcalin du gel d'électrophorèse. Ce traitement
transforme les fragments d'ADN double brin (ou bicaténaires) en fragments d'ADN
monobrin (ou monocaténaires).

4- Transfert des fragments monocaténaires du gel d'agarose à un support souple


(feuille de nylon par exemple). 
Le transfert des fragments monocaténataires du gel d'agarose à un support type
nylon s'effectue par simple capillarité.

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5- Fixation des fragments monocaténaires d'ADN sur le support souple et
hybridation dans des conditions optimales de stringence avec une sonde
complémentaire marquée à un radioisotope. 

Les fragments monocaténaires d'ADN transférés sur un support souple (nylon)


sont mis en présence d'une sonde qui va s'hybrider dans des conditions
physico-chimiques bien définies. on parle de conditions optimales de
stringence. La sonde s'apparie avec les fragments d'ADN monocaténaire selon
les règles de complémentarité. De plus, elle est marquée avec un radioisotope
(soit à son extrémité 5', soit à l'intérieur de la chaîne polynucléotidique ).

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6- Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie). 
Après de nombreux lavages, le support solide est mis en contact
avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le film est
ensuite révélé. Les bandes d'ADN monocaténaires hybridées avec
la sonde radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur
un fond blanc. La position de ces bandes par rapport à des témoins
de poids moléculaire permet de déterminer la taille de ces
fragments. 

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Applications

· Southern
· Northern
· Dot
· Western Blot
· hybridation in situ
 

HYGIENE DU PERSONNEL 21
Le Southern Blot
Objectif 

visualiser et cartographier un fragment du génome (ADN) dont on possède une sonde.

Préparation de l'ADN à étudier


 digestion par une enzyme de restriction adéquate
 séparation des fragments par électrophorèse
 dénaturation de l'ADN par incubation du gel d'électrophorèse dans une solution de
soude
 transfert de l'ADN sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon par un flux de
liquide entraînant l'ADN
 fixation covalente de l'ADN sur la membrane (nitrocellulose ou nylon).

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Préhybridation

Avant contact avec la sonde et avec la membrane, préincuber la membrane avec


de l'ADN pour en éliminer tous les sites qui n'ont pas été saturés par l'ADN lors du
transfert.

Hybridation

Ajouter la sonde dénaturée à la solution d'hybridation. La température d'hybridation


étant définie par la Température de la sonde soit ~65°C pour une sonde de + de
100 bases.

Lavages

Autoradiographie

La membrane est mise en contact avec un film photosensible.

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Southern Blot 24
Southern Blotting

ADN total

Autoradiogramme
Clivage par des enzymes de restriction

Electrophorèse sur gel d’agarose Révélation par


une sonde 32P
Gel d’agarose

Membrane
Transfert sur
nitrocellulose
Southern Blotting

Poids

kg
1
~ Plaque de verre
Papiers absorbants
Papiers Whatman
Membrane
Gel
Mèche
Support
Tampon de transfert
Le
LeNorthern
NorthernBlot
Blot
Le
Leprincipe
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d’agarose dénaturant (Ex: Formaldéhyde)
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sur filtre,
filtre, l’hybridation
l’hybridation avec
avec une
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mêmesque quepour
pourleleSouthern
SouthernBlot
Blot
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La visualisation d'un ARN par une sonde permet de : 

- de mettre en évidence la présence ou l’absence d’un ARN

- apprécier sa distribution dans les tissus: étudier son abondance


relative et apprécier des variations quantitatives d’un ARN d’un type
ou d’un état cellulaire à un autre (faible estimation)

- déterminer sa taille

- détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes


d'épissage (splicing ) de l'ARN.

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Le Dot Blot
Objectif : quantifier un ARN ou fragment d'ADN donné sans séparation préalable sur
gel d'électrophorèse.

- Le Dot Blot (hybridation sur tache) permet d’apprécier la présence ainsi que la quantité
d’un ADN/ARN donné au sein d’une population hétérogène d’ADNs/ARNs sans
séparation préalable

- Des dilutions d’un ADN/ARN étalon sont déposées sur une feuille

de nylon et sur une autre rangée sont déposées des dilutions de

la solution contenant la molécule d’ADN/ARN que l’on veut doser

- Après immobilisation des ADNs/ARNs et hybridation avec une

sonde, la membrane est autoradiographiée.

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- L’intensité des taches de la solution à doser est comparée à
celle de la gamme étalon

0.1 0.5 1.0 5.0 10


Gamme étalon

Dilutions de la molécule à doser


1 1/2 1/10 1/20 1/100

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L'hybridation in situ
 Sur chromosome métaphasique
 Sur coupe de tissu 

 Sur colonie de bactéries, sur plage de lyse 

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Sur chromosome métaphasique
 Objectif : déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène dont
on possède la sonde.
 En pratique

 les chromosomes sont préparés en métaphase à partir de lymphocytes circulants ou


d'une lignée lymphoblastoïde. L'hybridation est réalisée directement sur les préparations
cytogénétiques fixées sur lame. La sonde utilisée est marquée au tritium qui possède un
rayonnement très court et donc donne une localisation fine de la zone émettant la
radioactivité. L’émulsion radiosensible est coulée directement sur la préparation et on
laisse exposer plusieurs jours à semaines. Le résultat est lu sous microscope : les signaux
positifs apparaissent sous forme de grains noirs disposés sur les chromosomes.

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Sur coupe de tissu
Objectif : déterminer quelle sous population du tissu exprime un
ARN donné. En effet un tissu est généralement constitué de
différents types cellulaires, pas toujours faciles à séparer. 

 En pratique

la technique est proche de celle décrite sur les chromosomes. 

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Sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
Objectif : détecter parmi un grand nombre de bactéries ou de phages recombinants
celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherché (criblage de banque).
 En pratique

 la banque est étalée sur une ou plusieurs boîtes de Pétri, puis une empreinte de
chaque boîte est réalisée par le dépôt d'une membrane (nylon ou nitrocellulose)
pendant qq instants. La membrane contenant qq bactéries ou phages de chaque
clône, est placée dans une solution de soude pour faire éclater les bactéries ou
phages et dénaturer l'ADN. Après fixation, hybridation et autoradiographie, il est
possible de localiser le clône d'intérêt.

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Merci de m’avoir prêté attention

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