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Immunoenzymologie

ELISA

Immuno
enzyme linked Immuno assay
enzyme linked assay
Sorbent
Sorbent
Généralités

Est un examen de laboratoire: dosage immuno-enzymatique sur support solide.


Est un examen de laboratoire: dosage immuno-enzymatique sur support solide.

Cette méthode est principalement utilisée pour évaluer la présence d’Ag et d’Ac dans des
Cette méthode est principalement utilisée pour évaluer la présence d’Ag et d’Ac dans des
échantillons.
échantillons.

Donc: est un outil efficace pour déterminer aussi bien des concentrations sériques d'Ac (test HIV
Donc: est un outil efficace pour déterminer aussi bien des concentrations sériques d'Ac (test HIV
par exemple) que pour détecter la présence d'un Ag.
par exemple) que pour détecter la présence d'un Ag.
Principe des techniques immunologiques
Composé coloré
spectrophotométrie

+
Ac-traceur Antigène Composé
signal fluorescent
fluorimétrie
substrat
+
Ac Antigène-traceur

Emission de lumière
luminescence
Dosages immunoenzymatiques (ELISA) ou immuno-fluorescents (ELISA)

La technique d'ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) aussi


appelée EIA (Enzyme Immuno Assay) a été mise au point au début des
années 1970 par deux chercheurs de l'université de Stockholm, Eva
Engvall et Peter Perlmann

la technique ELISA repose sur une réaction immunologique se déroulant sur un


support solide et révélée par une réaction enzymatique en phase liquide. La mesure
de la réaction colorée finale se fait à l'aide d'un spectrophotomètre. Un fluorochrome
est utilisé pour révéler la réaction dans la variante FLISA (Fluorescence-Linked
ImmunoSorbent Assay)
Principe d’ELISA
La technique d’ELISA est une technique de détection permettant  de visualiser une réaction antigène-
anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action d'une enzyme

Substrat d’enzyme

Enzyme

Anticorps marqué

Antigène

Support
Les antigènes d'intérêt ou les anticorps spécifiques sont immobilisés sur le
support solide selon le type d'ELISA utilisé. On distingue plusieurs types
d'ELISA en fonction de la nature de la molécule à doser et de la technique
de révélation : ELISA direct, indirect, sandwich ou compétition
Les types d’ELISA

ELISA ELISA par


ELISA Indirect
Direct Compétition

ELISA d’un seul sandwish ELISA par compétition d’Ag

ELISA double sandwish ELISA par compétition d’Ac


Différents types d'ELISA utilisables selon l'analyte
recherché : antigène ou anticorps
A n a ly te r e c h e rc h é T y p e d e t e c h n iq u e A n a ly te a d s o r b é P r e m ie r r é a c t if D e u x iè m e r é a c t if R é a c t if s o lu b le d e
E L IS A s o lu b le s o lu b le r é v é la tio n
A n t ig è n e A n t ig è n e A n t ic o r p s d e / S u b s tra t/
d é te c t io n m a r q u é c h ro m o g è n e
D ir e c t
A n t ic o r p s A n t ic o r p s A n t ig è n e m a r q u é / S u b s tra t/
c h ro m o g è n e
A n t ic o r p s I n d ir e c t A n t ig è n e A n t ic o r p s p r im a ir e A n tic o r p s s e c o n d a ir e S u b s tra t/
m a rq u é c h ro m o g è n e
A n t ig è n e S a n d w ic h A n t ic o r p s d e c a p t u r e A n t ig è n e A n t ic o r p s d e S u b s tra t/
d é t e c t io n m a r q u é c h ro m o g è n e
A n t ic o r p s A n t ig è n e A n t ic o r p s A n t ic o r p s m a r q u é S u b s tra t/
c h ro m o g è n e
C o m p é t it if
A n t ig è n e A n t ic o r p s A n t ig è n e A n t ig è n e m a r q u é S u b s tra t/
c h ro m o g è n e
ELISA direct

Substrat d’enzyme

Enzyme

Anticorps marqué

Antigène

Support
ELISA indirect

Substrat d’enzyme

Enzyme
Anticorps
secondaire

Anticorps
primaire

Antigène

Support
La première étape clé de l'ELISA repose sur l'immobilisation de la molécule à
adsorber sur un support solide, le plus généralement des microplaques (de 96 ou 384
puits) de polystyrène à fond plat à haute capacité d'adsorption.

Il s'agit d'une adsorption passive directe réalisée grâce à l'établissement de liaisons


non covalentes de type hydrophobe et ionique entre le plastique et les résidus non
polaires ou ioniques des protéines.

Cette étape s'effectue classiquement en tampon alcalin type Phosphate-Buffered


Saline (PBS) pH 7,4 ou carbonate–bicarbonate pH 9,6 afin d'ioniser les molécules en
solution lors de cette étape.
 

Les différentes étapes de la réalisation d’une technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

- Fixation de l’antigène sur la plaque (certaines plaques sont commercialisées avec l’antigène déjà fixé)
- Dépôt du sérum du patient et incubation
- Lavage
- Ajout des anticorps anti-immunoglobulines humaines marqués par un enzyme
- Lavage
- Ajout du substrat incolore
- Mesure spectrophotométrique de la réaction colorée
Etape1

Mettre les Ag dans un puits de


microplaque
incubation et agitation
Fixation d’échantillon d’Ag connu sur un
support
Mettre les Ag dans un puits de
microplaque
incubation et agitation
Fixation d’échantillon d’Ag connu sur
un support
Lavage d’Ag non fixé
Suivis par l’étape de Blocage

BSA ou un détergent
verser quelques gouttes du
sérum à tester
Fixation d’anticorps de sérum à
tester sur l’Ag
Ajoute l’Ac secondaire de
détection
Fixation de l’Ac de détection
Lavage des Anticorps de détection
non fixés
On verse la solution révélatrice
contenant le substrat de l’enzyme
Le substrat se fixe sur l’enzyme (voir
coloration)
ELISA sandwich

Anticorps II aire
marqué

Antigène

Anticorps I aire
ELISA double sandwich

Anticorps marqué

Anticorps
secondaire

Antigène

Anticorps
primaire
ELISA par compétition d’Ag
Il s’agit d’une technique dont laquelle des Ag* et non marqués d’une même espèce
entrent en compétition vis-à-vis d’un nombre limité de site de liaison d’Ac

Antigène marqué

Antigène
Ag non marqué Ag marqué Ag non marqué Ag marqué
Sérum a tester >> Sérum a tester <<

Le signal est inversement proportionnel à la concentration de l’Ag à doser


1. Réalisation d’une courbe d’étalonnage avec des solutions d’Ag de concentrations connues

Intensité signal
Courbe
d’étalonnage

[Ag] marqué ng/ml

Le signal est inversement proportionnel à la concentration de l’Ag à doser.

2. Dosage avec le sérum du patient.


Détermination de la concentration d’Ag contenu dans le sérum à l’aide de la courbe étalon.
Lecteur de microplaques

A longeur d’onde variable A longeur d’onde fixe

 Donner une large gamme  Donner la valeur d’absorbnce à


d’onde 200nm à 800nm une seule longeur d’onde par exp:
490nm; 630nm; 405nm…..
Détermination de la concentration d’Ag ou d’Ac

Elle consiste à mesurer l’activité catalytique de l’enzyme utilisée, après addition de son substrat
Les résultats sont exprimés en unités ELISA par millilitres (EU/ml).

On réalise à partir d'une solution-mère une série de dilutions successives d’Ag ou d’Ac afin de tracer une
courbe d'étalonnage.

Ensuite a partir de cette courbe d'étalonnage, on peut extraire la concentration d’Ac ou d’Ag dans un
sérum d’un malade
A S1
B S2
Témoins= concentrations
C
croissantes connues d’Ag ou
D Serum à tester
d’Ac
E
F
G
H

Blanc

imprimante Lecteur de microplaque


Abs S1

A
B

C
D
E Abs S1<Abs S2
F
G
H

Abs S1
Référence
MOYENNE AbsMOYENNE
Serum malade
Ou Témoin

0.272
0.284 0.267 0.266 1.088 0,653
1.097 1.02
Concentration d’Ac ou d’Ag

0.305 0.288
0.28 0.279 0.655 0,822
0.683 0.679

0.354 0.341
0.333
es
vi d
ts
0.471
0.453 0.464

ui
0.755
0.872
0.883 0.979 s p
de
1.188 1.192
1.197 1.192 bs
A

Blanc 0.09 0.091


0.088 0.095
Absorbance

Concentrations d’Ac ou d’Ag


connues
Référence
MOYENNE Abs MOYENNE
Serum malade
Ou Témoin

0.272
0.284 0.267 0.266 1.088 0,653
1.097 1.02
Concentration d’Ac ou d’Ag

0.305 0.288
0.28 0.279 0.655 0,822
0.683 0.679

0.354 0.341
0.333
es
vi d
ts
0.471
0.453 0.464

ui
0.755
0.872
0.883 0.979 s p
de
1.188 1.192
1.197 1.192 bs
A

Blanc 0.09 0.091


0.088 0.095
Absorbance

Abs S1

Concentration d’Ac ou Ag

Concentrations Connues
Remarque: L'ELISA peut être réalisé à visée qualitative
ou quantitative selon que l'on utilise ou non une courbe
d'étalonnage (ou gamme étalon). Cette dernière doit
être réalisée avec une solution de concentration connue
de la molécule que l'on cherche à doser. Le seuil de
détection des ELISA quantitatifs est de l'ordre du pmol/L
ou du ng/mL. Des dosages semi-quantitatifs peuvent
être réalisés en comparant la densité optique obtenue
avec l'échantillon à celle d'une série de calibrateurs.
Méthodologie Les techniques ELISA comportent différentes étapes:

Adsorption des molécules: La première étape clé de l'ELISA repose sur


l'immobilisation de la molécule à adsorber sur un support solide, le plus
généralement des microplaques (de 96 ou 384 puits) de polystyrène à fond
plat à haute capacité d'adsorption.
Il s'agit principalement d'une adsorption passive directe réalisée grâce à
l'établissement de liaisons non covalentes de type hydrophobe et ionique
entre le plastique et les résidus non polaires ou ioniques des protéines.

Cette étape s'effectue classiquement en tampon alcalin type Phosphate-


Buffered Saline (PBS) pH 7,4 ou carbonate–bicarbonate pH 9,6 afin d'ioniser
les molécules en solution lors de cette étape.
Saturation du support adsorbant Après l'étape de liaison au support, il est néces-
saire de neutraliser les zones du support restées libres. Il s'agit de l'étape de
saturation qui permet d'éviter toute adsorption ultérieure de matériel présent
dans l'échantillon à doser ou lors de l'ajout des autres réactifs. Elle s'effectue par
ajout de
Première réaction antigène– anticorps Après la saturation de la plaque et
des lavages, le premier réactif soluble est déposé dans les puits et la plaque
est incubée. Pendant cette étape, les antigènes ou les anticorps en solution
vont se lier à la molécule adsorbée. Dans les ELISA directs, ce premier réactif
est couplé à l'enzyme.
Deuxième réaction antigène– anticorps (④) Après plusieurs lavages, sauf dans les
ELISA directs, le deuxième réactif soluble, couplé à l'enzyme, est déposé et la
plaque est incubée. Dans les ELISA indirects, ce réactif est un anticorps secondaire
dont plusieurs molécules peuvent se fixer à l'anticorps primaire, ce qui amplifie le
signal. Par ailleurs, cette alternative évite les risques de perte de réactivité de
l'anticorps primaire suite à son couplage chimique direct avec une enzyme ou la
biotine. Dans l'ELISA sandwich, en règle générale, l'anticorps de capture est un
anticorps polyclonal, alors que l'anticorps de détection est un monoclonal.
Révélation (⑤)
Après lavages, l'étape ultime de l'ELISA est la révélation consistant en l'ajout du substrat
et du chromogène spécifiques de l'enzyme.
Cette étape est réalisée dans un tampon adapté à l'activité enzymatique du système de
révélation. La mesure de la densité optique peut être réalisée en cinétique ou en point
fixe après arrêt de la réaction par ajout d'un tampon acide ou basique détruisant l'activité
enzymatique.
À ce stade, la quantité de signal émis est proportionnelle à la quantité de la molécule à
doser. Il est à noter que d'autres systèmes de révélation peuvent être employés,
notamment de type fluorométrique ou chimioluminescent en fonction du type de
substrat utilisé.
Dans ces cas, le support d'immobilisation doit être compatible avec le moyen de
détection, notamment un support opaque pour une révélation en chimioluminescence
Expression des résultats (⑥) Selon le type d'ELISA utilisé, différentes courbes de
titration peuvent être obtenues.
1 la v a g e s 2 la v a g e s 3 la v a g e s 4 la v a g e s 5

G am m e

blanc

D e n s ité o p tiq u e

D e n s ité o p tiq u e
n é g a tif
6
p o s it if

C o n c e n t r a tio n C o n c e n tr a tio n
Matériels utilisés pour ELISA
Microplaques
Ou
Micro-puits

24 puits 96 puits 384 puits


Papier absorbent
Papier absorbent
Incubateur et agitateur
Incubateur et agitateur
Lecteur de microplaques
Recommandations de mise en œuvre
Pour des résultats exploitables en ELISA et éviter la perte de sensibilité, il est nécessaire de trouver un bon
équilibre entre le signal spécifique émis et le bruit de fond non spécifique.
Ce bruit de fond résulte de l'adsorption de protéines contaminantes non éliminées lors des lavages et capables de
fixer de manière non spécifique les réactifs de révélation.
L'obtention d'un rapport signal/bruit acceptable nécessite d'optimiser l'étape de saturation, d'adapter les
concentrations des réactifs de capture et de révélation et de prêter un soin particulier aux lavages.
Le bruit de fond résultant des différentes étapes de manipulation est contrôlé par la réalisation de puits dits blancs
pour lesquels l'ensemble des étapes réactionnelles sont effectuées en l'absence de la molécule à doser remplacée
par une solution tampon de type PBS.
La densité optique des puits blancs est soustraite de la valeur obtenue pour les puits de dosage. La densité optique
des puits blancs doit être inférieure à 0,1. Si la densité optique des échantillons à doser dépasse la valeur de 2, les
résultats ne sont plus interprétables car l'absorbance n'est plus proportionnelle à la concentration (domaine de
validité de la loi de Beer-Lambert).
Il est alors nécessaire de diluer les échantillons et d'effectuer un nouveau dosage.
Avantages/inconvénients De manière générale l'ELISA est une technique sensible,
rapide, adaptée à la réalisation de grandes séries de dosage et offre la possibilité d'une
automatisation totale.

Exemples d'applications L'ELISA est une technique très couramment développée dans
le domaine du diagnostic biologique ou en recherche fondamentale.

 En recherche : le dosage de protéines d'intérêt dans des surnageants ou lysats cellulaires est réalisé
fréquemment en ELISA.
• Applications industrielles et vétérinaires : ces techniques sont également appliquées dans le contrôle qualité des
produits finis ou en cours de production, ainsi qu'en épidémiologie et contrôle vétérinaire.
• En clinique : l'ELISA est très utilisée pour le sérodiagnostic des maladies infectieuses et pour le diagnostic et le
suivi de maladies auto-immunes.

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