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MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS
RÁPIDOS

Dewin Marquez P.
Lila Maturana P.
Gisell Mercado P.
Alcides Oviedo P.
Laura Prada L.
Contenido

01 Introducción

02 Tipos de métodos
microbiológicos rápidos

03 Validación

04 Entrenamiento
Introducción

Los controles microbiológicos pueden brindar


información sobre la presencia o no de
microorganismos.

Los medicamentos pueden servir como un


ambiente propicio para el crecimiento de
microorganismos.

3
Métodos convencionales

Limitaciones

1 Resultados muy lentos

2 Incapacidad de identificar todos los


microorganismos presentes
3 Capacidad de cultivos

4
Métodos microbiológicos rápidos (RMM)

Proporcionan resultados de prueba más sensibles,


exactos, precisos y reproducibles en comparación con
los métodos convencionales basados en el
crecimiento.

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Usos de
los RMM

Se emplean como alternativas a:


● pruebas cualitativas para la presencia o
ausencia de microorganismos
● pruebas cuantitativas para la
enumeración de microorganismos
● pruebas cuantitativas de potencia o
toxicidad
● pruebas de identificación
VENTAJAS DE LOS RMM

Resultados más rápidos

05 Procesos más robustos

01
Mejor rendimiento
04 Reducción de errores

02
03
Eficiencia laboral

7
Aceptación Regulatoria
Con respecto al control y reducción de contaminación de microbios en productos, la FDA apoya a quienes:

Desarrollen métodos sensibles y de alto


rendimiento para la detección, Desarrollen y evalúen métodos para la inactivación /
identificación y enumeración de eliminación microbiana de productos farmacéuticos
contaminantes microbianos y validar su que no sean susceptibles de métodos convencionales
utilidad para evaluar la esterilidad del de esterilización.
producto.

Desarrollen materiales de referencia para uso de


Evalúen el impacto de procesos de
la industria y el mundo académico para evaluar y
fabricación específicos sobre la
validar métodos para detectar la contaminación
contaminación microbiana
microbiana.

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Tipos de Métodos Microbiológicos Rápidos
La RMM o los métodos alternativos se pueden clasificar en varios medios. Una forma es
basada en la tecnología o aplicación. Los métodos pueden agruparse en 6 categorías:

Métodos basados ​en el crecimiento

01
Análisis de componentes celulares

Amplificación de ácidos
03
nucleicos 02
Medición directa
05
04
Espectroscopía óptica

06 Sistemas microelectromecánicos 9
Métodos basados ​en el crecimiento

Medios selectivos
para la detección
rápida de
microorganismos 06 01 Microbiología
de impedancia
específicos

Tinción fluorescente y
recuento de 05 02 Detección de
microcolonias 1 dióxido de carbono
mediante excitación
láser

Utilización de
Uso de imágenes digitales y
autofluorescencia para la
04 03 sustratos
bioquímicos y
detección rápida y el carbohidratos
recuento de micro colonias

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Detección de dióxido de carbono

Tales métodos despliegan un sensor de dióxido de carbono colorimétrico


interno. El sensor se puede colocar dentro de una botella de medio (separado
del medio por una membrana semipermeable).

AWESOME
SLIDE

Microbiología de impedancia
La relación entre la capacitancia en la superficie del electrodo y la
conductancia de los cambios iónicos en los medios de los subproductos
producidos durante el crecimiento permite el cálculo de la impedancia..
Uso de imágenes digitales y autofluorescencia
para la detección rápida y el recuento de micro
colonias
Este método resuelve el problema de los métodos de cultivo en los que la
visualización de colonias requiere varios días.

AWESOME
SLIDE

Utilización de sustratos bioquímicos y


carbohidratos
De manera similar, los detectores presentes en los medios pueden detectar
reacciones microbianas.
Medios selectivos para la detección rápida de
microorganismos específicos
Este enfoque estándar puede automatizarse mediante la detección de
secuencias específicas de ácidos nucleicos Dichos sistemas descomponen las
muestras a nivel genético, utilizando una reacción en cadena de la polimerasa

AWESOME
(PCR) para detectar bacterias y otros microbios.
 

SLIDE

Tinción fluorescente y recuento de


microcolonias mediante excitación láser
Este método es similar al descrito anteriormente
Medición Directa

Citometría de flujo y
Citometría en fase
sólida

2
Demostración del marcado
directo de células individuales
con tintes de viabilidad o
marcadores fluorescentes sin
necesidad de crecimiento
celular

14
Demostración del marcado directo de células
individuales con tintes de viabilidad o
marcadores fluorescentes sin necesidad de
crecimiento celular

AWESOME
SLIDE

Citometría de flujo y Citometría en fase sólida

Con estas tecnologías, la capacidad para teñir microorganismos con tintes


como el yoduro de propidio, que es impermeable a las células con membranas
intactas, y el tiozol naranja, que es permeable a todas las células, permite una
diferenciación de células bacterianas viables y no viables en medios fluidos.
Análisis de componentes celulares

Bioluminiscencia de ATP

Prueba de Endotoxinas

Ionización por desorción láser asistida por matriz

16
Bioluminiscencia de ATP

Bioluminiscencia Palabra Griega: Bios (vida)


Palabra Latina: Lumen (Luz)

Vibrio fischeri Vibrio harveyi Photobacterium phosphoreum Photinus pyralis


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Bioluminiscencia de ATP

ATP

Principal fuente de energía


química de todas las células vivas

La oxidación de luciferina por la enzima luciferasa es la base del


fenómeno de bioluminiscencia
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Bioluminiscencia de ATP

• En la actualidad, existen
numerosos sistemas que utilizan
dispositivos del tipo escobillón o
hisopo para la toma de muestra
y luminómetros portátiles,
robustos, sensibles y fáciles de
utilizar que ofrecen lecturas
rápidas (en menos de 1 min) del
nivel de ATP

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Bioluminiscencia de ATP

DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN BACTERIANA EN SUPERFICIES

El hisopo está recubiertos con un agente catiónico para ayudar


a recolectar una muestra líquida y liberar adenosín trifosfato
(ATP) de células intactas. Al activar la prueba, el reactivo en la
cubeta del instrumento reacciona con el ATP recolectado en los
anillos de recolección de muestras para producir luz.

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Prueba de Endotoxinas

La historia del descubrimiento del reactivo LAL


comienza en 1956 cuando el doctor Frederick Bang
reporta la muerte por coagulación intravascular en el
cangrejo herradura americano Limulus polyphemus

Limulus polyphemus

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Verificar

• Que todos los materiales y reactivos a usar no contengan


endotoxinas bacterianas.
• La sensibilidad del lisado
• La ausencia de factores interferentes en las muestras a analizar.

Nota: Los resultados son válidos siempre que se haya demostrado


previamente que las muestras a analizar no inhiban ni intensifiquen
la reacción.

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Ionización por desorción láser asistida por matriz

La ionización MALDI
(desorción/ionización
mediante láser asistida
por Matriz), acoplada a
un analizador TOF
(tiempo de vuelo), es una
técnica de ionización
suave utilizada en
espectrometría de masas

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Espectroscopía óptica

Los métodos de espectroscopia óptica utilizan dispersión de luz y otras técnicas ópticas para detectar,
enumerar e identificar microorganismos (por ejemplo, contadores de partículas en el aire en "tiempo real").

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Amplificación de Ácidos Nucleicos

 Riboimpresión
Se aprovecha que la secuencia 16S del ARNr está altamente conservada a nivel de género y
especie.

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MÉTODOS DE PCR
• La PCR amplifica secuencias específicas de ADN a lo largo
del genoma microbiano.

• Más de 100 genomas microbianos han sido secuenciados, la


posibilidad de utilizar la información genética para la detección y
discriminación de los microorganismos es interminable.

• Esta técnica ha sido eficiente en la detección de Salmonella


typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Aspergillus
brasiliensis, y secuencias eubacteriales después de un período
de incubación

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SECUENCIACIÓN DE
GENES

• Secuenciación de genes (marcaje con


colorante específico). Esta es una variante del
método de PCR. Con el método, un analizador
genético separa los fragmentos por tamaño y
un láser detecta el color de fluorescencia de
cada tinte, produciendo una secuencia
genética completa del ADN diana.

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SISTEMAS MICROELECTROMECÁNICOS

 MICROARREGLOS DE ADN

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SELECCIÓN DE
MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS
RÁPIDOS

29
• Al elegir implementar una RMM, es
importante asegurarse de que el nuevo
método apropiado para las fórmulas,
instalaciones y personal de la empresa.
Por ejemplo, La introducción de un
PARA TENER EN CUENTA… método con un mayor nivel de
sensibilidad debe estar alineada con la
biocarga existente en materias primas,
medio ambiente y productos terminados.
La guía para la implementación de
métodos rápidos está disponible tanto en
la USP y el Ph.Eur.

● USP <1223>, Validación de métodos microbiológicos alternativos.


● Ph. Eur. 5.1.6., Métodos alternativos para el control de la calidad microbiológica.
30
● Ph. Eur. 2.6.27, Control microbiológico de productos celulares.
Consideraciones clave

• Considerar el riesgo beneficio


--la finalidad definida del método
de ensayo;
- el tipo y la profundidad de la
información requerida;
- las limitaciones del método
convencional y lo que el método
rápido podría ofrecer.

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Consideraciones clave

si existe la necesidad de la captura


electrónica de datos?
- si el método necesita ser automatizado?
- si es necesario conectar un aparato o
vincular el método a un sistema de gestión
si el método rápido conducirá a de la información del laboratorio (LIMS)?
una reducción del error
humano;
si hay una reducción de la
subjetividad;
si el método alternativo precisión
detectará con mayor precisión
en comparación con un método - tiempo necesario para
convencional? preparar la prueba; -
- ¿es el método rápido
tiempo
más rápido, equivalente
o más lento?
- el tiempo necesario
para realizar la prueba;
- el rendimiento de la
muestra
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Obstáculos internos de la empresa

• Rendimiento de la inversión
- costes de explotación del método convencional;
- costes de explotación e inversión del RMM;
- ahorro de costes y evitación de costes del método rápido.
• Costo-beneficio
- El desembolso de capital y los costos de funcionamiento
dependerán del RMM elegido y del equipo adquirido.

33
Validación

Validación
La evaluación del equipo

Evaluación de los materiales que el


RMM evaluará
34
Validación

definir la
característica de la
prueba actual que el
Estrategia de validación en los diferentes grupos
RMM debe
reemplazar
de métodos

Métodos Métodos
demostrar la determinar las
cualitativos cuantitativos
equivalencia del medidas pertinentes
RMM con el método que establecen la
actual en ausencia de
la muestra de
equivalencia del
RMM con el método
• Exactitud • Exactitud
producto
Estrategia actual
• precisión • Precisión
de • Especificidad • Especificidad
validación • Límite de • Linealidad
detección • Rango
• Robustez • Robustez
demostrar la
equivalencia del
Esto puede requerir
RMM con el método
un análisis
establecido en
estadístico
presencia de la
muestra de ensayo.
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Cualificación del equipo

Introducción

mediante la
calificación de
Origen y
aprobación del
Roles y instalación (IQ)
responsabilidades
plan

Validación
del plan de
val – idation Calificación
(VP) operativa (OQ)

Descripción del
Derivación
sistema

Calificación de
rendimiento
Descripción (PQ)
general del
sistema

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Transferencia de método

Validación completa del Equipo


• IQ, OQ, PQ

Validación completa del método


• Debe demostrarse que el método proporciona resultados
equivalentes o comparables al laboratorio original

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Entrenamiento

• Proporcionar suficiente capacitación


para garantizar una implementación
exitosa y completa de los nuevos
métodos
• Los métodos rápidos que requieren
pasos de preparación diferentes a los
métodos tradicionales requerirán
capacitación adicional y
actualizaciones del procedimiento
operativo estándar (POE)

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Bibliografía

• Sandle, T. (2015). Pharmaceutical Microbiology Essentials For


Quality Assurance And Quality Control. 1st ed. Woodhead
Publishing-Elsevier, pp. 219-231.
• Mondragón, G. (2010). Bioluminiscencia en el control de higiene.
Revista Énfasis.
• Bartoszcze, M., Bielawska, A. (2004). ATP Bioluminescence for the
detection and identification of Biological threats. Military Institute
of Hygiene and Epidemiology, Lubelska 2, 24-100 Pulawy, Poland.

39
Muchas Gracias

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