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La démarche diagnostique bactériologique

Votre rôle Penser à une infection


Penser à une infection bactérienne
Faire la preuve de l’infection bactérienne
Vous donner les moyens d’attendre la confirmation
Adapter la conduite à tenir et la thérapeutique

Faire le(s) bon(s) prélèvement(s),


dans les bonnes conditions,
au bon moment,

Connaître les bactéries pathogènes,


les conditions de leurs isolements,
le profil classique de sensibilité au traitement
L’analyse diagnostique bactériologique

Pour le diagnostic direct de l’infection

Voir, isoler, prouver la virulence de la bactérie et proposer le schéma thérapeutique

prélèvement EXAMEN DIRECT


CULTURES

IDENTIFICATION
SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES

Pour le diagnostic indirect de l’infection


SEROLOGIE
RECHERCHE ANTIGENES BACTERIENS
L’analyse diagnostique bactériologique (suite)

PRELEVEMENT Plusieurs techniques


Milieux transports

Conditions de prélèvement +++

EXAMEN DIRECT Interprétation +++

+
CULTURES Plusieurs supports
Plusieurs conditions

Adaptation +++

Premier jour Première classification


L’analyse diagnostique bactériologique (suite)

IDENTIFICATION
Méthodes variables
Standardisation

+/-

SENSIBILITE ANTIBIOTIQUES

Fonction de l’identification
Technique de référence
Milieux liquides

Deuxième Jour Deuxième classification


EXAMEN DIRECT
Les techniques d’observation : MICROSCOPIE

Deux principes
Non fixé, état frais Fixé, marqué ou coloré

Présence de bactéries Présence de bactéries


Agencement bactérien Forme bactérienne
Mobilité bactérienne Affinité colorant

Présence de réaction cellulaire

Colorations classiques Colorations spécifiques

Bleu de Méthylène Ziehl Neelsen (résistance acido-alcoolique, BAAR)


GRAM +++ Colorations des germes intracellulaires
Marquage Ag de paroi spécifique avec Ac fluorescent
CULTURES
SOLIDES LIQUIDES

Automate de détection
En boîtes, en tubes

Types de milieux Standard ou minimun (tryptica-soja)


Enrichis (sang, charbon, sang cuit)
Sélectif (détergent, cristaux, Antibiotique)
Synthétique (une seule source de carbone et énergie)

Conditions de culture Standard


Orientation particulière
IDENTIFICATION
Les techniques d’identification PHENOTYPIQUE

Diagnostic d’orientation
Aspect des colonies en culture
Profil de sélectivité des cultures

Tests rapides Catalase Microscopie


Oxydase
Mobilité
Forme
Spores
Confirmation
Profil biochimique
Profil chromatographique de la paroi (spécialisé)
Séro-groupage (kits commerciaux limités mais standard)
Recherche de marqueurs de virulence spécifiques (toxines ++)
Sensibilité à des réactifs particuliers (composé O129, optochine)
IDENTIFICATION (suite)
Les techniques d’identification GENOTYPIQUE
Principe
À partir de cultures bactériennes
Extraction du matériel génétique
À partir de prélèvement (indication limitée)

Matériel ADN +++


Etude du matériel nucléique obtenu
Matériel ARN parfois

Analyse d’homologie de séquence


Indirecte (restriction) Gel en Champ pulsé

Directe (amplification) Hybridation sur membrane


Séquençage
Biopuce
Recherche d’un gène particulier et spécifique
Gène ARN16S
Gène de virulence
Applications

Intérêt à discuter +++ Diagnostic bactériologique difficile ou impossible


Diagnostic bactériologique long
IDENTIFICATION (suite)
Extraction ADN

Amplification PCR
Restriction Amplification

Séparation Hybridation

12 34 5 6 7

Analyse de séquence comparative

Gène à étudier

référence

Signaux positifs
Analyse comparative
des signaux
Orientation vers diagnostic bactériologique
Examen direct interprété (site de prélèvement)
Faire la distinction entre flore normale, de colonisation …et l’infection

Flores commensales

Cutanée :
Staphylocoques coag neg, Enterococcus ssp
corynébactéries, Acinetobacter ssp,
propionibacterium ssp

Oro-pharyngée:
Streptococcus ssp, anaérobies,
Neisseria ssp, corynébactéries

Digestive :
Anaérobies, Escherichia coli, Entérobactéries

Vaginale :
Lactobacilles
Orientation vers diagnostic bactériologique (suite)

Infection Sites fermés et stériles

Colonisation anormale
Présence d’une modification de la flore commensale
Sites ouverts mais normalement stériles

Recherche de la réponse cellulaire (présence Pnn)

Pathogènes opportunistes Pathogènes « obligatoires »

Statut de l’hôte Virulence bactérienne

Immunodépression sévère Toxines +++


Complications chirurgicales
Exemples
Infection
Liquide Céphalo-rachidien Articulaire

Prélèvements pour ECBU

Prélèvement de Selles

Colonisation anormale

Modification flore