Université Badji Mokhtar .

Annaba
Faculté de Médecine
Service d’immunologie

EXTRACTION, PURIFICATION
EXTRACTION, PURIFICATION
ETREVELATION
ET REVELATION
DESACIDES
DES ACIDESNUCLEIQUES
NUCLEIQUES
(ADNET
(ADN ETARN)
ARN)
 INTRODUCTION

PRÉPARATIONS DES ÉCHANTILLONS

EXTRACTION ET PURIFICATION

RÉVÉLATION ET QUANTIFICATION

Pla
SÉPARATION

n
CONSERVATION

CONCLUSION
 INTRODUCTION
• les premières étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire.
• Objectifs :
 Libérer les acides nucléaires (rendre les AN accessibles aux systèmes
analytiques)
 Eliminer les contaminations responsables de
- La dégradation de ces acides nucléiques
o Interaction irréversible avec les acides nucléiques
o Une toxicité pour le manipulateur (le LPS en cas de d’utilisation
d’acides nucléiques d’origine bactérienne).
Rappel sur les acides nucleiques
Les• propriétés physico-chimiques :
Viscosité : l’ADN cellulaire est très grand et mince, une molécule relativement
rigide, par conséquent les solutions d’ADN ont une viscosité élevée.
• Dénaturation chimique : plusieurs agents chimiques peuvent dénaturer l’ADN à
pH neutre. exemple: l’urée et le formamide La concentration relativement
élevée de ces agents fractionne la liaison hydrogène des grosses molécules
d’eau. Cela signifie que la stabilisation énergétique d’une structure secondaire
d’un acide nucléique produite par l’élimination de l’eau entre les bases
hydrophobes superposées est réduite et que les brins sont dénaturés.
• Densité : l’ADN possède une densité d’environ 1,7 g/cm3
 Les propriétés thermiques et spectroscopiques :
• Absorption (UV) : La longueur d’onde d’absorption maximale d’un rayon par
l’ADN est de 260 nm. Les propriétés d’absorption peuvent être utilisées pour la
détection, la quantification et l’évaluation de la pureté.
• Dénaturation thermique : être observé par l’augmentation de l’absorption lors de la
conversion des acides nucléiques bicaténaires en monocaténaires. Les deux brins
se séparent suite à la destruction des liaisons hydrogène de l’ADN db. Le passage
au sb s’objective par simple mesure de la variation de la DO à 260 nm (effet
hyperchromique). Le point d’inflexion correspond à ce qu’on appelle la
température de fusion (Tm).
• Renaturation : la dénaturation thermique de l’ADN peut être renversée par le
refroidissement de la solution,
Préparation des
échantillons
PREPARATION DU MATERIEL
BIOLOGIQUE :
- Préparation à partir du sang total :
10 à 30 ml de sang sur anticoagulant, de préf l’EDTA .
Les échantillons peuvent voyager par la poste à température ambiante ; il est possible ensuite de les
conserver congelés à -20°C pdt plsrs mois. Il est primordial que l’ensemble des opérations soit
effectué stérilement, et que la décongélation ait lieu juste avant l’extraction.

- Préparation à partir de tissus ou de cellules en culture :

biopsies (par ex biopsies de villosités choriales lors d’un diagnostic prénatal) ou des cultures de
cellules (amniocytes, lignées lymphoblastoïdes…). Les cellules sont homogénéisées en présence de
détergent avec un petit appareil de Potter
Les pièces histologiques doivent être congelées dans de l’azote liquide.
Conservation :

1. ADN: est relativement résistant a la dégradation.

• Les spécimens peuvent rester quelque temps à +4 C ou même envoyé par poste a T ambiante. La
stabilité augmente avec la congélation.
• Les pièces histologiques doivent être congelées dans de l’azote liquide.
• Les pièces fixées (formol ou éthanol et incluses dans des blocs de paraffine) peuvent être utilisés
comme source d’ADN.

2. ARN: est très fragil.

• Les spécimens ou leurs sous fractions doivent être congelés a -80 C dans les 3 heurs qui suivent
le prélèvement.
• En cas d’expédition, les échantillons doivent être envoyés dans de la carboglace.
• Il existe toutefois un mode de recueil sur tubes spéciaux qui permet de conserver des
prélèvement sur une longue période sans affecter qualitativement ou quantitativement les ARN
messagers.
 Etapes fondamentales

• Rupture des membranes cellulaires;

Lyse des • Dénaturation des complexes nucléoprotéiques pour libérer
échantillons les acides nucléiques;
• Inactivation des nucléases endogènes

• Élimination des protéines et de certaines catégories

Extraction et d’acides nucléiques si nécessaire;
• Purification de l’acide nucléique :
purification • Précipitation
des acides • Chromatographie
nucléiques • Fixation sur silice;
• Etc.
 Lyse des échantillons
Par tampon de lyse et/ou des moyens mécaniques.

Le tampon de lyse contient :

1. Un détergent : solubiliser la membrane cellulaire.

Ex : SDS (Sulfate Dodecyl Sodium), Triton X-100, Sacrosyl, Tween 20 et
CTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide).
NB : CTAB peut précipiter l’ADN et élimine le LPS des bactéries et plantes.

2. Des enzymes qui attaquent les protéines membranaires :

Ex : - Protéinase K qui clive les glycoprotéines et peut inactiver les DNA/RNAases;
- Lysosyme qui dégrade la paroi des bactéries Gram +;
- Zymolase, et murienase.

3. Des agents dénaturants des protéines (Chaotropes) :

Ex: - EDTA;
- Sels du guanidinium (thiocyanate de guanidinium) : puissant inactivateur des
RNAases;
- Iodure de sodium, Urée.
 Lyse des échantillons
Pour lyser les échantillons, on utilise un tampon de lyse et/ou des moyens mécaniques.

Les moyens mécaniques utilisés :

- Sonification;
- Utilisation des sphères rigides et des billes (system FastPrep®-24);
- Pulvérisation et broyage dans une solution d’azote liquide.

Indiqués dans le cas des échantillons :

- Difficilement Lysés par les tampons de lyse;

- Riches en DNAases ou RNAases.
 Elimination des protéines

élimination des histones eucaryotes.

• hydrolyse enzymatique :
réalisée en faisant agir une endoprotéase non spécifique comme la protéinase K,
active jusqu’à 65°C Cette digestion est souvent conduite en présence d’un détergent
dénaturant comme le SDS qui facilite l’action de la protéinase K car il déploie la
chaîne protéique.
• Précipitation des protéines en utilisant un agent chaotropique :
Un agent chaotropique est un sel (donc des ions) qui modifie la solubilité des
molécules
(protéines ou acides nucléiques) et qui peut provoquer leur précipitation. Certains
sont dénaturants d’autres pas.
Extraction et
purification
 LES PRINCIPALES METHODES DE
PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
A- Méthodes en phase liquide:

A-1: extraction par des solvants organiques

A-2: extraction par Salting out (relargage)

A-3: extraction par centrifugation sur chlorure de césium

B- Procédés d’extraction en phase solide

B-1: extraction en utilisant des matrices de silice

B-2: extraction en utilisant des résines échangeuses d’anions

B-3: extraction en utilisant des billes magnétiques

B-4: purification des ARN messagers eucaryotes par chromatographie d’affinité

 A- Méthodes en phase liquide:

A-1: extraction par des solvants organiques

Extraction au phénol/chloroforme :

• Lorsque deux solutions non miscibles sont mélangées, les constituants des deux phase
vont se trouver après séparation des deux phases , dans celle où ils sont les plus
solubles (Principe de l’extraction par séparation de phases).

• le phénol, un déprotéinisant puissant dans lequel les AN ne sont pas solubles, le

chloroforme qui complète l’extraction phénolique en dénaturant les protéine

Remarque : L’extraction phénol-chloroforme appliquée à la purification de l’ARN =

extraction phénol acide-chloroforme
 La phase aqueuse contient le tampon de lyse des cellules, les protéines, les lipides et les
acides nucléiques.
 La phase organique représentée par le phénol, solubilise et extraire les protéines et les
lipides.
 Les deux phases doivent être bien mélangées.
 Après séparation des deux phases par centrifugation, la phase aqueuse est récupérée, elle ne
contient que les acides nucléiques.

L’affinité des acides nucléiques (ADN et ARN) pour ces deux phases est pH dépendante :
 Le phénol Basic (pH=8) est utilisé pour séparer l’ADN des protéines, des lipides et de
l’ARN
(L’ADN est insoluble dans le phénol Basic);
 Le phénol acide (pH=4) est utilisé pour séparer l’ARN des protéines, des lipides et de
l’ADN
(L’ARN est insoluble dans le phénol Acide).
 A- Méthodes en phase liquide:

A-1: extraction par des solvants organiques

 l'extraction au chloroforme : pour éliminer toutes traces de phénol aqueux.

Toute trace de phénol doit être éliminée pour permettre l’action ultérieure
d’enzyme (de restriction par exemple) sur l’acide nucléique extrait.
 Le chloroforme est additionné d’alcool isoamylique un agent antimousse
stabilisant la séparation des phases (agent déstabilisant de l’émulsion).
 Le chloroforme peut extraire aussi les lipides résiduels dans la phase aqueuse.
 La phase aqueuse obtenue est pure en acides nucléiques.
 Les acides nucléiques dans cette solution sont dilués, une précipitation est
nécessaire (Ex: par l’éthanol) puis une resuspension dans une solution appropriée.
Phénol = agent déprotéinisant

2500 tpm
 B. Précipitation des acides nucléiques
Par certains solvants en milieux salin.
récupérer les acides nucléiques sous forme solide, ce qui permet d’une part de les protéger, d’autre
part, après séchage, de les re-solubiliser à la concentration souhaitée.

1. Sels :
- Acétate d’Ammonium
- Chlorure de Sodium;
- Chlorure de Lithium (précipite sélectivement l’ARN mais non pas l’ADN, les protéines et les
carbohydrates).

2. Solvants :

- Ethanol +++ : plus utilisé car le précipité est facilement séché et contient peu de sels;
- Isopropanol;
- PEG (Poly Ethylène Glycol) : moins utilisé car séchage difficile et interférence avec les
techniques en aval.
Précipitation à l’alcool éthylique :
• elle doit être effectuée en utilisant un sel, le NaCl, qui augmente la dissolution des
acides nucléiques et leur agrégation : les ions Na+ (du NaCl) neutralisent les
groupements phosphates PO4- des acides nucléiques les rendant moins hydrophiles et
donc moins solubles.
• L’éthanol doit aussi être à haute concentration (2,5 volumes d’éthanol à 95° par volume
d’échantillon).
• Dans ces conditions les acides nucléiques sont presque totalement précipités et
apparaissent sous une forme non soluble
• Pour les faibles concentrations d’ADN et d’ARN (< 50μg/ml) les temps de précipitation
doivent être très long (> 10 heures).
• Les précipitations sont accélérées par le froid (-20 à -70°C), qui permet d’éviter
l’hydrolyse des acides nucléiques et évite aussi la volatilisation de l’éthanol.
• Le précipité est récupéré par centrifugation.
Avantages : Très bon rendement; Très bonne pureté des acides nucléiques; Très grande
durée de vie des acides nucléiques (des années).
Inconvénients : toxicité pour le manipulateur (par le phénol); Si le tampon de lyse contient
beaucoup de sels, une inversion des phase peut se produire (la phase aqueuse en bas),
phénomène qui devient critique si le phénol est incolore; Contamination entre ADN et ARN
est fréquente après utilisation d’un tampon de lyse a base de GTC (Guanidium ThioCyanate).
Ethanol mobilise l’eau du milieu
& diminue la solubilité de l’ADN

2500 tpm
 A- Méthodes en phase liquide:
A-2: extraction par Salting out

•  Basée sur la différence de solubilité des molécules en présence de sels

• Cosmotrope : diminue la solubilité d’une molécule =Salting out’).
• technique qui utilise des solutions salines à forte concentration d’acétate d’ammonium
(7,5M) ou de chlorure de sodium saturé (6M),
• les sels minéraux à forte concentration nécessitent d’être entourés par des molécules
d’eau, phénomène se produisant au détriment des protéines qui se trouvent privées d’eau.
Il en résulte une surconcentration de sel qui favorise l’agrégation des protéines et leur
insolubilisation.
 Après centrifugation, un précipité blanc se forme qui contient les composants insolubles (protéines
etc.)
 La solution résiduelle est riche en acides nucléiques, mais contaminée par les sels;
 Une précipitation et des lavages sont nécessaires (ex : par l’éthanol).
 B- Procédés d’extraction en phase solide
B-1: extraction en utilisant des matrices de silice
(technique Quiagen : QIAmp DNA Blood Mini Kit) Lyse
• les particules de silice adsorbent sélectivement les acides nucléiques.
• Les interactions entre les acides nucléiques sont de type hydrophobe.

₰ Le Tampons de lyse assure la lyse des échantillons et apporte aussi Liaison des
les sels et le pH de liaison des acides nucléiques à la résine; acides
nucléiques
Avantages : Simplicité ++++; Rapidité; Très bonne pureté et rendement (dépend des tampons de liaison et des lavages).
₰ Liaison des acides nucléiques à la résine, et passage des
Inconvénients : Perte des acides nucléiques (liaison à la résine et le filtre), phénomène critique avec de faibles quantité
contaminants (protéines, lipides etc.);
d’échantillon et un grand volume de la résine; Dépendance de la qualité des réactifs (tampons); Dépendance de l’étape de
lyse (les cellules intactes se lient aussi à la résine de silice); Risque de liaison irréversible des acides nucléiques à la résine
₰ Plusieurs lavages sont effectués par une solution contenant des sels
(séchage de la résine). Lavages
et de l’éthanol, permettant d’éliminer les contaminations et l’excès de
sels (sans détacher les acides nucléiques);

₰ Elution par une solution à faible concentration saline

Elution
(Tampon TE).
 B- Procédés d’extraction en phase solide

B-2: extraction en utilisant des résines échangeuses d’anions

• En milieu neutre les acides nucléiques se comportent comme des anions Lyse

• interaction entre les charges négatives des groupements phosphates de l’ADN et

₰ Avantages : rapide et n’utilisant pas de substances toxiques.

₰lesUne
charges positives du support de chromatographie (exp : di-ethyl-amino-ethyl- Liaison des
partie des acides nucléiques n’est jamais récupérée de la résine (à cause des forces de liaisons); acides
nucléiques
₰cellulose DEAE-cellulose)
l’utilisation d’un tampon d’élution concentré en sels, nécessite une étape de précipitation qui entraine :

• Les
• protéines et les
Une perte du autres molécules en solution sont éliminés par un tampon
rendement;
Lavages
moyennement charge
• Une perte de en sels, puis élution de l’ADN par un tampon a forte force
temps.

ionique, l’ADN sera ensuite précipité par l’alcool.

Elution
 B- Procédés d’extraction en phase solide
B-3: extraction en utilisant des billes magnétiques
• interaction des acides nucléiques avec des billes magnétiques recouvertes de silice ou d’hydroxyapatite

dans des conditions de tampon optimales.

• Les billes magnétiques sont caractérisées par une grande surface, une répartition uniforme et une bonne

stabilité de suspension.

La lyse de l’échantillons est réalisée en utilisant du Tampon de lyse et de la Protéinase K. L’ADN/ARN se

lie aux billes magnétiques et est séparée de la solution par des tiges magnétiques contrôlées par

l’automate. Après trois étapes de lavage, les billes liées aux acides nucléiques sont transférées dans le

puits du tampon d’élution et l’ADN/ARN est finalement élué dans le TE. Les échantillons de PCR

hautement purifiés sont transférés dans la plaque d’élution.

 B- Procédés d’extraction en phase solide

B-4: extraction des ARNm par chromatographie d’affinité

La très grande majorité des ARN messagers eucaryotes possèdent une queue constituée d’une
longue séquence polyadénylique qui peut dépasser 100 A consécutifs. Cette caractéristique est
mise à profit pour les purifier par affinité. Pour cela les ARN totaux sont passés sur colonne
d’oligo dT-cellulose ou de poly U-Sépharose®. La séquence poly A des messagers s’hybride avec le
poly U ou l’oligo dT, et ceux-ci sont de ce fait fortement fixés à la colonne. Après lavage, qui
élimine les ARN non fixés, les ARN poly A+ sont élués par abaissement de la force ionique. Ils sont
récupérés de l’éluat par précipitation par l’alcool éthylique absolu froid (-20°C).
Avantages : Très grande pureté; Renforcement de la spécificité des techniques en aval.
Inconvénients : Perte d’une partie des ARNm lors de la purification → diminution du rendement;
Possibilité de contamination par l’ARNribosomal; Dépendance de la qualité de préparation de la
résine cellulose-oligo (dT).
 Purification d’ADN plasmidique

la purification de l’ADN plasmidique pose un problème de contamination par l’ADN

génomique.

₰ Les stratégies de purification sont basées sur les différences physiques entre l’ADN
linéaire, plasmidique et super hélicoïdale:

L’ADN plasmidique à la particularité de se renaturer (revenir à l’état

basal) plus rapidement que l’ADN génomique (linéaire ou super
hélicoïdal ) après une étape de dénaturation.
 Méthode alcaline
1. Préparation de culture bactérienne
et lyse des bactéries (tampon de lyse
contient Tris-EDTA-Glucose-
Lysosyme);
2. dénaturation des acides nucléiques et
protéines en milieu alcalin (NaOH 2N
+ SDS);
3. Renaturation de l’ADN plasmidique en
milieu acide (solution d’Acétate de
Potassium 3M pH 4.8);
4. À l’exception de l’ADN plasmidique,
tous les contaminants (protéines,
ADN génomique, lipides et SDS) sont
éliminés par une extraction phénol
chloroforme.
Méthode à la chaleur
1. Préparation de culture bactérienne
et lyse des bactéries (tampon de
lyse contient Triton X100-CTAB-
Lysosyme);
2. Dénaturation des acides nucléiques
par chauffage ( Ex : 65 °C pendant
45 min);
3. Renaturation de l’ADN plasmidique
par le froid (Ex: mettre le mélange
dans la glace pendant 5 min);
4. À l’exception de l’ADN plasmidique,
tous les contaminants (protéines,
ADN génomique, lipides et SDS)
sont éliminés par une extraction
phénol chloroforme.
Révélation et
quantification
 Spectrophotométrie

La concentration en ADN est déterminée par mesure de la DO au spectrophotomètre à la longueur

d'onde de 260 nm pour des solutions diluées au 1/50 ou 1/100. Cette absorption est proportionnelle à

la concentration de l'ADN (une unité de densité optique (DO) à 260 nm correspond à 50ug d'ADN

double brin par μl) en tenant compte de la dilution réalisée.

L'estimation de la concentration de l'ADN est déterminée selon la formule suivante :

[ADN] = DO260 × facteur de dilution × 50 ng/μl

le rapport DO260/ DO280, qui doit être compris entre 1,7 et 2

< 1,7 => Contamination par les protéines → 2eme extraction.

> 2 => Présence d’ARN.

 ASPECT DES ARN SUR GEL D’AGAROSE
ARN totaux
non dégradés
Marqueur de
PM (1kb) ARN totaux
dégradés

Afin de vérifier la qualité de l’ARN après extraction, la technique la plus commune est la migration de
l’échantillon sur gel d’agarose 1,2 % suivie d’une visualisation sous lumière UV. Les deux bandes d’ARN
ribosomaux (18S à 1,9 kb et 28S à 5 kb) doivent être présentes. Si les ARN migrent sous la forme d’une
trainée (smear) et que les deux bandes ne sont pas visibles, l’échantillon d’ARN a sans doute subi une
dégradation.
La mesure du rapport 28S/18Sdoit être de l’ordre de 2 pour un ARN de bonne qualité.
Fluorimétrie
• L'ADN peut aussi être dosé avec plus de sensibilité et de spécificité par fluorimétrie
après coloration par un fluorochrome spécifique :
• - Fluorochrome spécifique des paires de bases A-T ou G-C : Hoechst 3342, DAPI ;
• - Fluorochromes intercalants : iodure de propidium, bromure d’éthidium ou acridine
orange.
• Cette technique est plus sensible que la spectrophotométrie. De plus il est possible de
travailler sur de plus faibles volumes (10 μL). Il faut disposer d’un fluorimètre.
• Cette méthode présente cependant un inconvénient : elle est sensible à la composition
en bases (le fluorochrome peut se fixer préférentiellement sur les ADN riches en A-T
ou G-C). Le standard utilisé devra avoir une composition en GC proche de celle de l’ADN
mesuré (les cellules eucaryotes ont une composition en GC de 39 à 46 %, en moyenne, et
les cellules procaryotes de 26 à 77 %).
• Cette technique ne quantifie pas l’ARN.
Séparation
 Electrophorèse d’ADN
• gel d’agarose ou de polyacrylamide
• permet l’identification, la séparation ainsi que la purification de fragments d’ADN en fonction
de leur taille,
• Les acides nucléiques étant des macromolécules poly anioniques uniformément chargées, elles
peuventLa
migrer dansd’ADN
quantité un champ électrique.
présente sur le gel peut être estimée grâce à l’intensité de
• Dansfluorescence
un milieu tamponé
émise (TBE,
par leTAE)
BET les acides nucléiques
(bromure d’éthidium)seront chargésadditionné
intercalant négativement Migrent
à l’ADN à
vers l’anode une concentration finale de 3%.
• La vitesse de migration dépend du nombre de paires de bases ou de bases ; la concentration du
gel en agarose.
• Les échantillons d’ADN à analyser, ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire, sont mélangés à
un colorant de charge, le bleu de bromophénol, ce qui permet de suivre leur migration au cours
de l’électrophorèse.
• La révélation se fait
Pouvoir
par le de séparation
Bromure d'ADN
d’éthidium linéaire,
(BET) double entre
qui s ’intercalle brin, les bases des acides
selon la concentration d'agarose du gel
nucléiques;
 Electrophorèse d’ADN

Le gel d’agarose n’est pas résolutif pour de

petits fragments d’ADN (Inférieurs à 100
pb)
Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose sont:

préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels

d'agarose

pas de dénaturation des échantillons

l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de

polyacrylamide

les échantillons peuvent être récupérés en vue

d'analyses supplémentaires
 Conservation de
l’ADN
L'ADN peut être conservé dans un tampon
(10mM Tris pH=8) additionné d'EDTA (1mM) à
4°C.
- A pH 8, la dégradation de l'ADN est
notablement plus faible qu'à pH 7.
- L'EDTA permet de chélater les ions divalents
(nécessaires de les piéger pour inactiver les
nucléases) et ils évitent aussi la croissance de
microorganismes.
L'ADN peut être également conservé à -20°C
dans le même tampon mais des cycles successifs
de congélation/décongélation entraînent des
cassures des acides nucléiques de grande taille
(>10kb). D’où la nécessité de réaliser des
fractions aliquotes pour la conservation si
nécessaire.
Conservation de
l’ARN
Du fait de la très faible stabilité des
ARN, les échantillons sont stockés à
-80°C après addition de
3 vol d'éthanol. En l'absence de sels,
ils restent en solution.
Une aliquote représentative peut être
prélevée après agitation puis ajustée à
0,3M d'acétate de sodium pH 5,2 qui
provoque la précipitation de l’ARN
brièvement à -20°C et collectée par
centrifugation.
MERCI POUR VOTRE
ATTENTION